Echtzeit-Bildgebung der Makrophagen-Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen

Nehmen Sie einen Kanalobjektträger mit Mausmakrophagen. Der Kanal ist mit mediengefüllten Reservoirs verbunden und versorgt Makrophagen mit Nährstoffen.

Ersetzen Sie Medien durch medienhaltige, fluoreszenzmarkierte Antikörper, die an spezifische Oberflächenglykoproteine binden und Makrophagen markieren.

Nehmen wir menschliche rote Blutkörperchen, RBCs, mit fluoreszenzmarkierten Zellmembranen. Opsonisieren Erythrozyten mit Maus-IgG-Antikörpern, die spezifisch an das Glykophorin A binden.

Fügen Sie die IgG-opsonisierten Erythrozyten zum Makrophagen-haltigen Objektträger hinzu. Makrophagen-Fc-Rezeptoren binden die Fc-Region von IgGs an Erythrozyten, was zu einer Clusterbildung von Fc-Rezeptoren um die Kontaktfläche führt und die Erythrozyten für die Phagozytose markiert.

Die Bindung löst intrazelluläre Signalwege aus und aktiviert GTPasen. Aktivierte GTPasen treiben die Reorganisation und Polymerisation von Aktinen voran und bilden dünne Membranvorsprünge, die als Filopodien bezeichnet werden.

Darüber hinaus erstrecken sich Filopodien um die Erythrozyten und schließen sie in den sich entwickelnden phagozytischen Becher ein. Die Ränder des Bechers verschmelzen und bilden ein Phagosom, das die opsonisierten Erythrozyten für den Abbau internalisiert.

Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Sie Zeitrafferbilder von einzelnen phagozytären Ereignissen.

Um die Peritonealmakrophagen zu markieren, ersetzen Sie das Bikarbonatmedium in jedem Kanalobjektträger durch vollständiges Medium, das mit HEPES ergänzt ist, und kippen Sie den Objektträger so, dass 100 Mikroliter des fluoreszenzmarkierten Mausmakrophagen-spezifischen Antikörpers von Interesse tropfenweise in die Öffnung des 100-Mikroliter-Kanals des Objektträgers gegeben werden können. Saugen Sie das Medium an, das in das nachgeschaltete Reservoir fließt, und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid.

Während die Bauchfellzellen markiert werden, mischen Sie die 4 bis 2.000 roten Blutkörperchen vorsichtig und überführen Sie 400 Mikroliter der Zellen für etwa 5 bis 8 Minuten in ein neues 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in einem beheizten Aluminiumblock in einer Laminar-Flow-Haube.

Wenn sich die Zellen auf 37 Grad Celsius erwärmt haben, mischen Sie 0,4 Mikroliter einer geeigneten rot fluoreszierenden Plasmamembranfärbung mit den Zellen und legen Sie die Zellen wieder in den Wärmeblock. Waschen Sie die Zellen nach 5 Minuten, indem Sie 1,6 Milliliter frisches, mit HEPES ergänztes Komplettmedium und eine Zentrifuge hinzufügen. Drehen Sie das Röhrchen, um das Pellet der roten Blutkörperchen zu identifizieren.

Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze von 1 bis 1,5 Millilitern vorsichtig den Überstand in zwei Volumina, ohne das Pellet zu stören. Mischen Sie dann 2.000 Mikroliter frisches, mit HEPES supplementiertes Komplettmedium mit den Zellen. Zentrifugieren Sie das Pellet und resuspendieren Sie es in 400 Mikrolitern Medium. Beschriften Sie dann das Röhrchen mit PMS für Plasmamembranfärbung. Waschen Sie den Objektträger am Ende der 20-minütigen Inkubation zur Peritonealzellmarkierung mit 1 Milliliter frischem, vollständigem, mit HEPES supplementiertem Medium.

Um die roten Blutkörperchen zu opsonisieren, geben Sie 1 Mikroliter monoklonalen Maus-IgG2b-Antikörper gegen den Menschen CD235a in das PMS-Probenröhrchen. Nach 8 Minuten bei 37 Grad Celsius mit einmal pro Minute Mischen werden 100 Mikroliter der plasmamembrangefärbten, IgG-opsonisierten, menschlichen roten Blutkörperchen auf den peritonealen Makrophagen-haltigen Kanalobjektträger übertragen. Sobald die menschlichen roten Blutkörperchen hinzugefügt wurden, montieren Sie den Objektträger auf ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop, wobei der Tischinkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und beginnen Sie sofort mit der Bildgebung der Zellen.