Eine Technik zur Beurteilung der in vivo Lokalisation von tumorspezifischen Antikörpern

Nehmen Sie eine Suspension von menschlichen Eierstockkrebszellen. Fügen Sie ein Basalmembran-Matrix-Medium hinzu und lassen Sie es auf Eis, um Gelbildung zu vermeiden.

Geben Sie die Mischung in eine Spritze und injizieren Sie sie subkutan in eine athyme Nacktmaus. Entfernen Sie die Nadel, sobald die Matrize geliert ist, um ein Ausstoßen der Mischung zu verhindern.

Das Fehlen einer Immunantwort bei der immundefizienten Maus erhält die Lebensfähigkeit der injizierten Zellen. Die extrazellulären Matrixproteine und Wachstumsfaktoren des Gels liefern wachstumsfördernde Signale und erleichtern die Tumorbildung.

Tumorzellen exprimieren den oberflächengebundenen Folatrezeptor alpha-1 oder FOLR1 überexprimiert.

Nehmen Sie FOLR1-spezifische Antikörper ein. Fügen Sie einen Fluoreszenzfarbstoff hinzu und inkubieren Sie, was eine Farbstoffkonjugation mit den Antikörpern ermöglicht.

Injizieren Sie die markierten Antikörper intravenös in die anästhesierte tumortragende Maus.

Antikörper gelangen über den Blutkreislauf in den Tumor und binden an FOLR1 auf Tumorzellen, wobei sie die Zelloberfläche fluoreszierend markieren.

Führen Sie In-vivo-Fluoreszenzbildgebung durch. Bei Anregung emittiert der Farbstoff Fluoreszenz, was die Beurteilung der Antikörperlokalisation im Tumor erleichtert.

0,5 Milliliter des Antikörpers werden mit einer Dialysekassette in 1 Liter Konjugationspuffer dialysiert. Übertragen Sie die Dialysekassette nach vier Stunden in einen frischen Puffer und dialysieren Sie sie über Nacht. Um eine Konjugationsreaktion in Gang zu setzen, fügen Sie 0,03 Mikrogramm IRDye 800CW pro 1 Milligramm Antikörper in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Reinigen Sie dann die markierten Konjugate durch umfangreiche Dialyse gegen PBS. Schätzen Sie den Grad der Markierung, indem Sie die Absorption des Farbstoffs bei 780 Nanometern und die Absorption des Proteins bei 280 Nanometern messen.

Um Xenotransplantate für Mäuse zu entwickeln, heben Sie vorsichtig die Haut des Tieres an und trennen Sie sie von der darunter liegenden Muskelschicht. Injizieren Sie langsam 100 Mikroliter Zellsuspension mit einer 26-Gauge-Nadel unter die Haut. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausnehmen, damit das Basalmatrixmedium zusammen mit Zellen unter der Haut eine halbfeste gelartige Struktur bilden kann, die verhindert, dass die Mischung aus der Injektionsstelle austritt.

Um eine In-vivo-Bildgebung durchzuführen, injizieren Sie den Farbstoff-markierten Antikörper über die Schwanzvene. Überprüfen Sie nach der Betäubung der Maus, ob sie nicht auf Pedalreflexe reagiert, und erweitern Sie die Vene, indem Sie warmes Wasser auftragen. Verwenden Sie eine 1-cm³-Insulinspritze mit einer 26-Gauge-Nadel, um 25 Mikrogramm des markierten Antikörpers in einem Volumen von 100 Mikrolitern zu injizieren. Als Negativkontrolle wird der unspezifische IgG-Isotyp-Antikörper, der nicht auf Krebszellen abzielt, markiert und injiziert.

Führen Sie 8, 24 und 48 Stunden nach der Antikörperinjektion eine In-vivo-Bildgebung durch. Klicken Sie in der Imaging-Software auf Initialisieren. Vergewissern Sie sich, dass die Tischtemperatur 37 Grad Celsius beträgt. Richten Sie in der Systemsteuerung die Fluoreszenzbildgebung über den Bildgebungsassistenten ein, und stellen Sie die Anregung auf 773 Nanometer und die Emission auf 792 Nanometer ein.

Übertragen Sie die anästhesierte Maus in die Bildgebungskammer und positionieren Sie sie mit dem Nasenkonus auf dem Bildgebungsfeld. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf dem Bedienfeld für die Bildaufnahme auf "Erfassen" und dann auf "Automatisch belichten". Das erzeugte Bild ist die Überlagerung der Fluoreszenz mit dem fotografischen Bild, wobei die Intensität der optischen Fluoreszenz in Einheiten von Zählungen oder Photonen angezeigt wird.