Färbung von bakteriellen Zellen und Vorbereitung für immunologische Studien

Beginnen Sie mit einem Röhrchen mit einer Bakterienkultur in der exponentiellen Phase, um gleichmäßige und aktiv wachsende Bakterien für konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu sammeln, saugen Sie den trümmerhaltigen Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen.

Führen Sie einen zellpermeablen roten Fluoreszenzfarbstoff ein. Farbstoffmoleküle dringen in die bakterielle Zellmembran ein und erreichen das Nukleoid, binden sich an die DNA und verleihen den Bakterien rote Fluoreszenz.

Zentrifugieren Sie, um die gefärbten Bakterien zu pelletieren, und aspirieren Sie den ungebundenen farbstoffhaltigen Überstand.

Resuspendieren Sie die Bakterien in ein Wachstumsmedium, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Messen Sie mit einem Photometer die Absorption der verdünnten Bakteriensuspension bei 600 Nanometern.

Vergleichen Sie den Absorptionswert mit einer Standardkurve, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen.

Übertragen Sie das gewünschte Volumen der gefärbten Bakteriensuspension in ein frisches Röhrchen, das ein Wachstumsmedium enthält. Dadurch soll die gewünschte Bakterienkonzentration für die Wirtszellinfektion erreicht werden, die die Multiplizität der Infektion (MOI) darstellt.

Die gefärbten Bakterien mit dem gewünschten MOI sind bereit für immunologische Studien.

Zuerst werden die Bakterienkulturen in einer exponentiellen Phase durch Zentrifugation bei 13.000 g für zwei Minuten bei Raumtemperatur geerntet. Nachdem Sie das Zellpellet mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie das Bakterienpellet in einem Milliliter PBS.

Bestimmen Sie die Konzentrationen der Bakteriensuspension durch Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern. Fügen Sie dann zum Färben der Bakteriensuspension zwei Mikroliter des 500-fach konzentrierten grünen oder roten Färbefarbstoffs in einen Milliliter Bakteriensuspension hinzu, um den Farbstoff um ein Vielfaches zu verdünnen. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit sanfter Drehung im Dunkeln.

Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die gefärbten Bakterien zwei Minuten lang bei 13.000 g und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS. Sammeln Sie die gefärbten Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 13.000 g für zwei Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem F-12K-Medium und messen Sie die optische Dichte jeder Kultur bei 600 Nanometern. Anschließend verdünnen Sie die Kulturen auf die gewünschten Konzentrationen, basierend auf der Vielzahl der Infektionen und der Konzentration der Wirtszellen.