Analyse der Basophilenaktivierung in Gegenwart eines Testallergens mittels Durchflusszytometrie

Nehmen Sie Zytometerröhrchen, die ein Färbegemisch aus fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern enthalten, die in einem Stimulationspuffer suspendiert sind.

Abnehmende Konzentrationen des Testallergens werden in mehrere Röhrchen gegeben. Geben Sie Anti-IgE-Antikörper in ein Röhrchen, das als IgE-vermittelte Positivkontrolle dient, und fügen Sie Puffer zu einem anderen Röhrchen für die Negativkontrolle hinzu.

Pipettieren Sie menschliches peripheres Blut in die Röhrchen. Ausbrüten.

Wenn die Person auf das Testallergen sensibilisiert ist, führt diese Exposition dazu, dass das Allergen an die allergenspezifischen IgE-Antikörper bindet, die an Fc-Rezeptoren auf der basophilen Oberfläche gebunden sind.

Allergene vernetzen IgE-gebundene Fc-Rezeptoren, was zu einer Basophilenaktivierung führt.

Basophile werden degranuliert, wobei intrazelluläre Granulate freigesetzt werden, die Entzündungsmediatoren enthalten, wobei die CD63- und CD203c-Moleküle hochreguliert werden.

Fluoreszenzmarkierte monoklonale Antikörper binden an CD63, CD203c bzw. CCR3 auf Basophilen.

Senken Sie die Temperatur, um die basophile Degranulation zu stoppen.

Fügen Sie Puffer hinzu, um die Erythrozyten zu lysieren und die Zellen zu fixieren.

Identifizieren Sie mit einem Durchflusszytometer die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation.

Unter Verwendung von CD63 als Aktivierungsmarker können Sie die basophile Aktivierung bei abnehmenden Allergenkonzentrationen analysieren.

Beginnen Sie mit der Entnahme von peripherem Blut in heparinisierten 9-Milliliter-Röhrchen und legen Sie die Proben in einen Rotor, um sie bei Raumtemperatur zu halten, bis sie für das Versuchsprotokoll benötigt werden.

Beschriften Sie jeweils zwei 5-Milliliter-Zytometerröhrchen für die Negativ- und Positivkontrolle. Beschriften Sie außerdem jeweils ein Röhrchen mit den verschiedenen Allergen- oder Arzneimittelkonzentrationen, die getestet werden. Legen Sie dann die Röhrchen in ein Gestell, so dass die Röhrchen perfekt passen, ohne zu verrutschen.

Für die erste Positivkontrolle bereiten Sie eine 4-mikromolare Lösung von N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin oder fMLP in 0,05 % PBST vor, um die Qualität der Basophilen zu bestätigen. Für die zweite Positivkontrolle bereiten Sie eine Anti-IgE-Lösung von 0,05 Milligramm pro Milliliter mit PBST vor. Bereiten Sie die Färbemischung vor, indem Sie jeweils 1 Mikroliter CCR3-APC-, CD203c-PE- und CD63-FITC-Antikörper pro 20 Mikroliter des Stimulationspuffers hinzufügen. Geben Sie dann 23 Mikroliter dieser Färbemischung in jedes Röhrchen.

Geben Sie 100 Mikroliter PBST in die Negativkontrollröhrchen, fügen Sie 100 Mikroliter fMLP in eines der Positivkontrollröhrchen hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter Anti-IgE in das andere hinzu. Zu den restlichen Röhrchen geben Sie 100 Mikroliter der verschiedenen Allergen- oder Arzneimittelkonzentrationen und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 100 Mikroliter Blut in jedes Röhrchen, um eine Hämolyse zu vermeiden. Anschließend werden die Röhrchen vorsichtig gewirbelt und 25 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Thermostatbad unter mittlerer Bewegung inkubiert.

Halten Sie die Röhrchen mindestens fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius, um die Degranulation zu stoppen. Geben Sie zu jedem Röhrchen 2 Milliliter Lysingpuffer, um die Erythrozyten zu lysieren. Wirbeln Sie jedes Röhrchen vor und inkubieren Sie die Röhrchen dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Drehen Sie dann das Gestell in die Spüle, um den Überstand zu dekantieren, während die Zellen am Boden der Röhrchen verbleiben. Geben Sie 3 Milliliter PBST in jedes Röhrchen, um die Zellen zu waschen, und wirbeln Sie die Röhrchen ein. Führen Sie eine zweite Zentrifugationsrunde mit denselben Parametern durch und dekantieren Sie den Überstand, indem Sie das Gestell in die Senke kippen. Bewahren Sie die Proben dann bis zur Durchflusszytometrie bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt auf.

Verbinden Sie das Durchflusszytometer mit der Computersoftware und warten Sie, bis das Zytometer bereit ist. Laden Sie die Vorlagen- und Instrumenteneinstellungen, wie im Textmanuskript beschrieben. Starten Sie den Prozess der Probenaufnahme.

Um aktivierte Basophile auszuwählen, holen Sie sich zunächst die Lymphozyten aus dem Side Scatter - Forward Scatter Plot. Holen Sie sich dann die Basophilen aus der Lymphozytenpopulation als CCR3-positive CD203c-positive Zellen und erwerben Sie mindestens 500 Basophile pro Röhrchen. Stellen Sie den negativen CD63-Schwellenwert mit den negativen Kontrollröhrchen auf ca. 2,5 % ein und analysieren Sie die Proben.