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Immunologie
0 Aufrufe • 2:40 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einem Zellpellet, das natürliche Killer- oder NK-Zellen und fluoreszenzgefärbte Zielzellen enthält.
Das Pellet in einem geeigneten Medium resuspendieren und inkubieren.
Die NK-Zelle interagiert über Oberflächenadhäsionsproteine und bildet eine immunologische Synapse mit der Zielzelle.
Dadurch wird die NK-Zell-Signalgebung eingeleitet und zytotoxische Granula, die Perforin und Granzyme enthalten, in die Synapse freigesetzt.
Perforin, ein porenbildendes Protein, erzeugt Kanäle in der Membran der Zielzelle, durch die Granzyme in das Zytoplasma gelangen können.
Granzym, eine Serinprotease, interagiert mit intrazellulären Proteinen und aktiviert den apoptotischen Signalweg in der Zielzelle.
Fügen Sie nun den Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid hinzu.
Der Farbstoff dringt durch die geschädigten Membranen in tote Zellen ein und bindet an die DNA, indem er zwischen ihren Basenpaaren interkaliert.
Folglich exprimieren die toten Zellen doppeltes Fluorochrom, während die lebenden Zellen einfaches Fluorochrom exprimieren.
Die Probe ist bereit für die Durchflusszytometrie, um die NK-Zell-induzierte Zytotoxizität durch Quantifizierung der Anzahl toter und lebender Zielzellen zu beurteilen.
Um eine Zytotoxizitäts-Assay-Probe vorzubereiten, markieren Sie zunächst 1,5-Milliliter-Röhrchen für jede Probe und/oder jeden Teilnehmer und pipettieren Sie das gewünschte Verhältnis von NK-Zellen und DiO-markierten K562-Zellen in jedes Röhrchen.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellmischung in 500 Mikrolitern unvollständigem NK-Zellmedium und markieren die Zellen in jedem Röhrchen mit 5 Mikrolitern Propidiumiodid.
Sammeln Sie die Zellen über eine weitere Zentrifugation und inkubieren Sie die Kaltkultur zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen unter den gleichen Zentrifugenbedingungen und resuspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern frischem und vollständigem NK-Zellkulturmedium.