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Immunologie
0 Aufrufe • 3:34 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein gekammertes Deckglas, das Mastzellen enthält – Immunzellen mit sekretorischen Granulaten oder SGs, die Entzündungsmediatoren enthalten.
Fügen Sie IgE-Antikörper zusammen mit einem pH-empfindlichen Fluoreszenzreporter hinzu und inkubieren Sie.
Die Antikörper binden an Fc-Rezeptoren auf Mastzellen. Die Reporter werden über die Pinozytose internalisiert, und die resultierenden Endosomen fusionieren mit SGs.
Entfernen Sie das Medium. Fügen Sie ein Antigen hinzu, das mehrere IgE-bindende Epitope enthält; Legen Sie den Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop und wenden Sie die erforderliche Anregungswellenlänge an.
Der saure pH-Wert von SGs löscht die Reporterfluoreszenz.
Das Antigen bindet an IgE-Rezeptorkomplexe auf der Zelloberfläche und vernetzt diese.
Die Antigen-vermittelte Rezeptoraggregation löst die Migration von SGs in Richtung der Plasmamembran aus.
SNARE-Proteine auf dem Plasma und der SG-Membran vermitteln die Membranfusion und die Abgabe von SG-Fracht, die als Exozytose bezeichnet wird.
Der höhere pH-Wert des Mediums bewirkt eine SG-Alkalisierung, wodurch die Reporter wieder fluoreszieren
.Eingehende SGs verschmelzen mit den membranabgesicherten. Die Alkalisierung des zweiten SG vermittelt die Fluoreszenzwiederherstellung und bestätigt die Exozytose der Verbindung.
Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein gekammertes Deckglas mit frischem FITC-Dextran-supplementiertem Kulturmedium und züchten Sie die RBL-Zellen über Nacht. Bereiten Sie zunächst eine endgültige Tyrode-Pufferlösung gemäß dem Textprotokoll vor. Bereiten Sie dann ein 20x Sekretagogenreagenz in dem frisch hergestellten Puffer vor.
Lösen Sie Ammoniumchloridpulver im Tyrode-Puffer auf, um eine 400-millimolare Ammoniumchloridlösung zu erhalten. Saugen Sie dann das Medium aus dem gekammerten Deckglas an und ersetzen Sie es durch 300 Mikroliter vorgewärmten Tyrode-Puffer. Nachdem Sie den Waschvorgang zweimal wiederholt haben, füllen Sie die Kammer mit 300 Mikrolitern Tyrode-Puffer auf.
Platzieren Sie dann das Deckglas mit der Kammer in der Inkubatorkammer eines Mikroskops und stellen Sie sicher, dass die Kammer stabil ist. Schalten Sie die Leuchtstoffröhre ein und wählen Sie den passenden Fluoreszenzfilter aus. Sobald der interessierende Bereich in der Mitte des Sichtfelds scharf ist, schalten Sie die Lichtquelle aus.
Schalten Sie dann den 488-Nanometer-Laser ein, wobei die Emission etwa 500 bis 550 Nanometer beträgt. Kalibrieren Sie als Nächstes das Zeitintervall zwischen den Bildaufnahmen. Stellen Sie die Scanrichtung auf "Bidirektional" ein. Lassen Sie keine Mittelwertbildung zu. Öffnen Sie die Lochblende, und stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 ein.
Als nächstes bilden Sie die Zellen für die für den jeweiligen Zelltyp oder Sekretagoge geeignete Dauer ab. Geben Sie dann 16 Mikroliter aus der Sekretagogenlösung in die Kammer und fahren Sie mit dem Filmen fort. Um schließlich das Vorhandensein und die Lokalisation von FITC-Dextran im sekretorischen Granulat zu bestätigen, geben Sie vorsichtig 16 Mikroliter Ammoniumchloridlösung in die Kammer.