JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 2:55 Min. • July 8th, 2025
Tauen Sie die Filterpapiere mit der absorbierten Nasenschleimhautschleimhautflüssigkeit auf Eis auf, um eine Verschlechterung der Probe zu verhindern.
Die Flüssigkeit enthält Immunmediatoren, darunter Chemokine und Zytokine.
Tauchen Sie die Filterpapiere in einen Puffer. Den Inhalt in Röhrenfilter umfüllen. Zentrifugen, um die Schleimhautauskleidungsflüssigkeit aus dem Filterpapier zu eluieren.
Geben Sie den gefilterten Nasenextrakt in die Assay-Platte, die mit einem Array von mediatorspezifischen Capture-Antikörpern strukturiert ist.
Die Immunmediatoren binden an die entsprechenden Antikörper.
Einführung von Nachweisantikörpern, die mit einem Ruthenium-Komplex markiert sind und an ihre jeweiligen Mediatoren binden.
Fügen Sie Tris-basierten Puffer hinzu, der Tripropylamin oder TPA enthält.
Wenn ein Potential an die Elektroden angelegt wird, oxidieren der Ruthenium-Komplex und TPA.
Das entstehende TPA-Radikal regt den Ruthenium-Komplex an.
Bei der Rückkehr in seinen Grundzustand emittiert der Ruthenium-Komplex Photonen.
Die gemessene Lichtintensität ist proportional zur spezifischen Immunmediatorenkonzentration in der Schleimhautflüssigkeit.
Für die Quantifizierung von Immunmediatoren der Atemwege legen Sie bis zu 10 Proben aus einer Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf Eis und notieren Sie deren Identifikationsnummern. Wenn die Proben aufgetaut sind, tauchen Sie beide Filterpapiere pro Motiv in 150 Mikroliter frisch zubereiteten Puffer pro Filterpapier.
Ergänzen Sie es mit einer vollständigen Proteasehemmer-Tablette pro 25 Milliliter Pufferstofflösung. Übertragen Sie die Proben für 5 Minuten bei 400 U/min in einen Plattenschüttler. Übertragen Sie den Puffer und das Filterpapier in die Becher der einzelnen Celluloseacetat-Schlauchfilter.
Zentrifugieren Sie die Proben, um den gefilterten Nasenextrakt am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Entferne dann die Becher und lege die Röhrchen auf Eis. Übertragen Sie anschließend 150-Mikroliter-Aliquots des Nasenextrakts in einzelne Vertiefungen mit Speicherplatten mit geringer Proteinbindung und lagern Sie die Platten bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius. Messen Sie dann die Konzentration der nasalen Immunmediatoren von Interesse mit einem hochempfindlichen Elektrochemilumineszenz-basierten Multiplex-Array gemäß Standard-Assay-Protokollen.