Verwendung von Immun-RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von SARS-CoV-2

Nehmen Sie fixierte und permeabilisierte Coronavirus-infizierte Vero-Zellen – eine Interferon-defiziente Säugetierzelllinie.

Im Inneren des Wirts liegt virale RNA als subgenomische oder sgRNAs vor, RNA-Moleküle mittlerer Länge, die für spezifische virale Proteine kodieren, die durch Transkription synthetisiert werden.

Fügen Sie Hybridisierungs-Kettenreaktions- oder HCR-Initiatorsonden hinzu.

Die HCR-Sonde bindet an ihre komplementäre Sequenz auf der Ziel-RNA.

Einführung der fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Hairpin-Sonden H-1 und H-2.

Die Initiatorsonde bindet an ihren komplementären H1-Schwanz, wodurch die Haarnadelstruktur linearisiert wird.

Die exponierte H1-Sequenz bindet an ihren komplementären H2-Schwanz.

Die nachfolgende H2-Sequenz setzt die Bindung an einen H1-Schwanz fort, amplifiziert fluoreszenzmarkierte Sonden um den Zielbereich herum und erzeugt ein robustes Signal.

Fügen Sie geeignete Antikörper hinzu, um das Zytoskelett der Wirtszelle sichtbar zu machen.

Färben Sie die Zellkerne mit DAPI.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop zeigen virusinfizierte Zellen eine rote Fluoreszenz im Zytoplasma, die auf das Vorhandensein der Ziel-RNA hinweist.

Nach dem Fixieren und Permeabilisieren der Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben, entfernen Sie die 1x PBS-Lösung aus den Vertiefungen und fügen Sie mindestens 300 Mikroliter Amplifikationspuffer zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Röhrchen abkühlen.

Um 300 Mikroliter Amplifikationslösung herzustellen, verwenden Sie 18 Picamole von jeder Haarnadel. Übertragen Sie die Haarnadellösung in Röhrchen und inkubieren Sie sie 90 Sekunden lang bei 95 Grad Celsius. Dann 30 Minuten im Dunkeln auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie die snap-gekühlten H1- und H2-Haarnadeln zum Amplifikationspuffer hinzufügen. Geben Sie Tropfen von 30 bis 50 Mikrolitern Haarnadelmischung auf Parafilm und inkubieren Sie die Proben über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Um die Objektträger zu montieren, geben Sie zwei 10-Mikroliter-Tropfen Eindeckmittel auf einen Objektträger und achten Sie darauf, dass die Tropfen ausreichend voneinander getrennt sind, damit zwei Deckgläser auf einem einzigen Objektträger platziert werden können. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Deckgläser auf ein sauberes Handtuch klopfen. Legen Sie sie dann mit den Zellen nach unten in ein lichtbeständiges Eindeckmedium. Legen Sie die eingespannten Proben im Dunkeln auf eine trockene, ebene Fläche und lassen Sie sie aushärten.