JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Immunologie
0 Aufrufe • 3:42 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Mikroplatte mit gleichmäßigen Scheidensegmenten, die aus Reissetzlingen geschnitten wurden, und Blattscheiben, die aus Reispflanzenblättern gewonnen wurden.
Fügen Sie steriles Wasser hinzu und inkubieren Sie über Nacht, um sich von der Wundbelastung zu erholen.
Fügen Sie ein immunogenes Peptid hinzu, das aus bakteriellen Flagellen gewonnen wird und als pathogen-assoziiertes molekulares Muster oder PAMP fungiert.
Pflanzenzellen an den Schnittkanten binden über Mustererkennungsrezeptoren an die PAMPs.
Die Bindung löst die nachgeschaltete Signalübertragung aus und aktiviert ein Plasmamembran-lokalisiertes Enzym, das als respiratorisches Burst-Oxidase-Homolog oder RBOH bezeichnet wird.
Aktiviertes RBOH produziert reaktive Sauerstoffspezies oder ROS im Apoplasten – dem Interzellularraum. Die erzeugten ROS werden in Wasserstoffperoxid umgewandelt.
Fügen Sie ein Peroxidase-Enzym und ein Chemilumineszenzsubstrat hinzu.
Die Peroxidase verwendet Wasserstoffperoxid, um das Substrat in ein angeregtes Zwischenprodukt umzuwandeln, das Energie als Licht freisetzt und in den Grundzustand zurückkehrt.
Messen Sie die Lumineszenz in beiden Gewebetypen, um einen starken Anstieg unmittelbar nach der PAMP-Behandlung zu erkennen, der auf einen ROS-Ausbruch hinweist.
Schneiden Sie die Scheide von 10 Tage alten Reissämlingen mit einer scharfen Rasierklinge oder einer chirurgischen Klinge in 3-Millimeter-Segmente zur Vorbehandlung einen Tag vor dem ROS-Assay. Legen Sie 5 Mantelsegmente für 10 bis 12 Stunden in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser.
Schneiden Sie die Blattscheiben von vier bis sechs Wochen alten Reispflanzen mit einer Biopsie-Stanze mit einem Kolben ab. Schneiden Sie die Blattscheiben immer aus dem mittleren Drittel des zweiten Blattes der Hauptfräse ab, um Datenschwankungen zu reduzieren. Als nächstes wird eine Blattscheibe zur Vorbehandlung 10 bis 12 Stunden lang in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser gelegt. Bewahren Sie alle Blattscheiben schwimmend und nach oben in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Wasservorbehandlung auf, um Schwankungen auf der Blattseite zu vermeiden.
Bereiten Sie die Auslöselösung vor, indem Sie 9,4 ml 50 mikromolare Tris-HCl, 400 Mikroliter L-012-Lösung, 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase und 100 Mikroliter flg22 kombinieren. Geben Sie 200 Mikroliter Auslöselösung in die Vertiefungen.
Starten Sie die Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Experimente, um ein neues Protokoll zu erstellen oder ein vorhandenes Protokoll zu verwenden. Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf Prozedur, um die Platte einzurichten und die zu überwachenden Wells aus der Platte auszuwählen. Klicken Sie auf Kinetic starten, und legen Sie die Laufzeit je nach experimentellen Anforderungen auf 30 Minuten oder länger fest. Wählen Sie das minimale Intervall, um die Messwerte so häufig wie möglich zu erhalten, und wählen Sie für die Integrationszeit je nach Signalintensität 1 Sekunde oder länger.
Klicken Sie auf Validieren und anschließend auf OK, um die Einstellungen zu bestätigen. Klicken Sie dann im Popup-Fenster auf Neue Platte erkennen und warten Sie, bis die Software das Dialogfeld für die Lastplatte anzeigt. Entfernen Sie vorsichtig das doppelt destillierte Wasser aus den Vertiefungen, die das vorbehandelte Gewebe enthalten, und vermeiden Sie dabei Gewebeschäden oder Austrocknung. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 Mikroliter der Erhebungslösung in die Vertiefungen mit dem Gewebe zu geben. Legen Sie die zu prüfende Platte auf den Träger und beginnen Sie mit der Erkennung.