Messung der Alloreaktivität in einer gemischten Population von T-Zellen

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte, die dendritische Zellen der Maus oder DCs enthält, die Alloantigene oder genetische Varianten von Selbstantigenen tragen.

Einführung von Maus-T-Zellen, einschließlich alloreaktiver T-Zellen, die nicht auf Selbstantigene reagieren, während fremde Antigene erkannt werden.

Die alloreaktiven T-Zellen erkennen diese Alloantigene und interagieren mit DCs, wodurch eine Umlagerung des Zytoskeletts, einschließlich der Reorganisation von F-Aktin, ausgelöst wird.

Dies fördert die Interaktion von Rezeptoren auf T-Zellen mit co-stimulatorischen Molekülen auf DCs und bildet eine zelluläre Verbindung – eine immunologische Synapse.

Fixieren Sie die Zellen, übertragen Sie sie in ein Röhrchen und führen Sie einen Cocktail aus Fluorochrom-markierten Antikörpern ein, die spezifisch für T-Zell- und DC-Rezeptoren sind und eine ausgeprägte Fluoreszenz verleihen.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper und resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer, der ein Permeabilisierungsmittel enthält, das die Zellen permeabilisiert, und grüne Fluorophor-markierte Proteinmarker, die an F-Aktin binden.

Die Zellen werden zentrifugiert und in einem Puffer mit Kernfarbstoff resuspendiert, wobei die Zellkerne rot gefärbt werden.

Identifizieren Sie mit Hilfe der bildgebenden Durchflusszytometrie die Dubletten – die T-Zell- und DC-Konjugate mit grünem Fadenkreuz aus F-Aktin entsprechen – und bestätigen Sie die Synapsenbildung.

Quantifizieren Sie die Dubletten, die den Grad der Alloreaktivität darstellen.

Beginnen Sie mit der Aussaat von 0,5 mal 10 bis zur sechsten dendritischen Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte, gefolgt von 1 mal 10 bis zur sechsten T-Zellen in einem Endvolumen von insgesamt bis zu 50 Mikrolitern Kulturmedium pro Well. Inkubieren Sie die kalten Kulturen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie dann das Dreifache des Kulturvolumens von 1,5 % Formaldehyd in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur in jede Vertiefung. Am Ende der Fixierung werden die Zellen aus jeder Vertiefung in ein entsprechendes 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen überführt und die Zellen mit den entsprechenden Fluorochrom-konjugierten Antikörpern in 100 Mikrolitern Waschpuffer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt gefärbt

.

Waschen Sie anschließend die Zellen in 1 Milliliter Waschpuffer und resuspendieren Sie die Pellets in Perm-Waschpuffer, der Phalloidin-FITC enthält. Nach weiteren 30 Minuten bei lichtgeschützter Raumtemperatur die Zellen in 1 Milliliter frischem Dauerwellen-Waschpuffer waschen. Resuspendieren Sie die Pellets in dem interessierenden Kernfarbstoff in Dauerwellen-Waschpuffer für eine abschließende 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, und waschen Sie die Zellen in 1 Milliliter Dauerwellen-Waschpuffer, gefolgt von einer Wäsche in Waschpuffer allein. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 50 bis 100 Mikrolitern frischem Waschpuffer und überführen Sie die Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen mit kleinem Deckel.

Um die Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu analysieren, reservieren Sie zunächst einen Kanal für die Hellfeldbildaufnahme und laden Sie die erste Steuerröhre. Wenn der Hellfeldkanal ausgeschaltet ist, erstellen Sie im Arbeitsbereichsfenster ein neues Streudiagramm für jeden Kanal, der mit dem Seitenverhältnis über dem Bereich verwendet wird, und begrenzen Sie die Unterteilungen, bei denen das Seitenverhältnis nahe eins liegt.

Überprüfen Sie für jedes Fluorochrom die positive Population und passen Sie die Laserspannung in der Beleuchtungsbox nach Bedarf an. Wählen Sie im Feld Kanäle die entsprechenden Kanäle für die Fluorochrome aus, die bei der Färbung verwendet werden. Klicken Sie dann auf Aufnehmen. Wenn die Anzahl der Ereignisse den angegebenen Schwellenwert erreicht, wird die Erfassung automatisch gestoppt.

Nachdem alle Einzelfleckenkontrollen erfasst wurden, laden Sie das erste experimentelle Probenröhrchen und erfassen Sie mehrere Zehntausend Ereignisse unter den entsprechenden Analysekanälen, einschließlich des Hellfeldkanals.