Eine Peptid-MHC-I-Tetramer-Färbetechnik zur Analyse von SIV-spezifischen CD8⁺-Gedächtnis-T-Zellen

Nehmen Sie mononukleäre Zellen (PBMCs) aus dem peripheren Blut von Nicht-menschlichen Primaten ein, die CD8⁺-Gedächtnis-T-Zellen gegen das Immundefizienzvirus (SIV) enthalten.

Fügen Sie einen Proteinkinase-Inhibitor hinzu, um die Internalisierung des T-Zell-Rezeptors oder TCR bei nachfolgender Stimulation zu verhindern.

Einführung des Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplexes Klasse I oder pMHC-I-Tetramere, fluorophor-konjugierte Komplexe, die aus vier MHC-I-Molekülen bestehen, die an SIV-spezifische Peptide gebunden sind. Diese Peptide binden an TCRs auf der Oberfläche von T-Zellen.

Fügen Sie eine Mischung hinzu, die Fluorophor-konjugierte Antikörper enthält, die an CD8, CD28 und CCR7 binden – Marker, die Gedächtnis-T-Zell-Untergruppen beschreiben – und Antikörper, die Nicht-CD8⁺-Zellen markieren.

Ein fluoreszierender Viabilitätsfarbstoff markiert tote Zellen.

Fixieren Sie die Zellen. Permeabilisieren Sie sie, um Zugang zu intrazellulären Zielen zu erhalten.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu, die CD3, einen T-Zell-Marker, und intrazelluläres Granzym B, einen aktivierten CD8⁺ T-Zell-Marker, binden.

Schließen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie Nicht-CD8⁺ T-Zellen