Ein Farbstofffreisetzungsassay zur Quantifizierung der enzymatischen Aktivität von antimikrobiellen Proteinen

Beginnen Sie mit einer Tube mit hitzeabgetöteter Bakteriensuspension und behandeln Sie sie mit einer Farbstofflösung.

Die Farbstoffmoleküle binden kovalent an das Peptidoglykan – einen wesentlichen Bestandteil der bakteriellen Zellwand – und verleihen ihm eine blaue Färbung.

Pelletieren Sie die Bakterien und entfernen Sie den Überstand mit ungebundenen Farbstoffmolekülen.

Resuspendieren Sie die Bakterien und führen Sie eine antimikrobielle Proteinlösung in das Röhrchen ein, wodurch die enzymatische Hydrolyse des bakteriellen Peptidoglykans ausgelöst wird, was zu einem Abbau der Zellwand und anschließender Zelllyse führt.

Dies führt zur Freisetzung der Farbstoffmoleküle, die eine blaue Färbung verleihen.

Fügen Sie Ethanol hinzu – ein Proteindenaturierungsmittel, das die antimikrobiellen Proteine inaktiviert und die enzymatische Reaktion beendet.

Zentrifugieren Sie den Inhalt, um die Zellfragmente und Enzyme zu pelletieren. Übertragen Sie den Farbstoffmolekül-haltigen Überstand auf eine Multi-Well-Platte.

Messen Sie mit einem Plattenleser die Extinktion bei 595 Nanometern.

Vergleichen Sie die Absorption der enzymbehandelten Probe mit der der enzymunbehandelten Probe, um die enzymatis