Ein Farbstofffreisetzungsassay zur Quantifizierung der enzymatischen Aktivität von antimikrobiellen Proteinen

Beginnen Sie mit einer Tube mit hitzeabgetöteter Bakteriensuspension und behandeln Sie sie mit einer Farbstofflösung.

Die Farbstoffmoleküle binden kovalent an das Peptidoglykan – einen wesentlichen Bestandteil der bakteriellen Zellwand – und verleihen ihm eine blaue Färbung.

Pelletieren Sie die Bakterien und entfernen Sie den Überstand mit ungebundenen Farbstoffmolekülen.

Resuspendieren Sie die Bakterien und führen Sie eine antimikrobielle Proteinlösung in das Röhrchen ein, wodurch die enzymatische Hydrolyse des bakteriellen Peptidoglykans ausgelöst wird, was zu einem Abbau der Zellwand und anschließender Zelllyse führt.

Dies führt zur Freisetzung der Farbstoffmoleküle, die eine blaue Färbung verleihen.

Fügen Sie Ethanol hinzu – ein Proteindenaturierungsmittel, das die antimikrobiellen Proteine inaktiviert und die enzymatische Reaktion beendet.

Zentrifugieren Sie den Inhalt, um die Zellfragmente und Enzyme zu pelletieren. Übertragen Sie den Farbstoffmolekül-haltigen Überstand auf eine Multi-Well-Platte.

Messen Sie mit einem Plattenleser die Extinktion bei 595 Nanometern.

Vergleichen Sie die Absorption der enzymbehandelten Probe mit der der enzymunbehandelten Probe, um die enzymatische Aktivität des antimikrobiellen Proteins zu quantifizieren.

Im Farbstofffreisetzungsassay wird das Substrat kovalent an den Farbstoff Remazol Brilliant Blue R oder RBB gebunden. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie eine 200-Millimolare RBB-Lösung herstellen. 1,25 Gramm RBB werden in einer frisch zubereiteten Natronlauge gelöst.

Als nächstes resuspendieren Sie hitzeabgetötete Bakterienzellen in einer Konzentration von 0,5 Gramm Nassgewicht in 30 Millilitern RBB-Lösung. Für gereinigtes Peptidoglykan resuspendieren Sie das Peptidoglykan in einer Konzentration von 0,3 Gramm Nassgewicht und 30 Millilitern RBB-Lösung.

Da die nachfolgenden Schritte unabhängig vom verwendeten Substrat gleich sind, wird die Markierung nur für die Bakterienzellen demonstriert. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch auf einer rotierenden Plattform sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter schonendem Mischen. Nach sechs Stunden wird das Reaktionsgemisch in einen 4 Grad Celsius heißen Inkubator überführt und weitere 12 Stunden unter schonendem Mischen inkubiert.

Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, ernten Sie das gefärbte Substrat durch Zentrifugation bei 3.000 mal g für 30 Minuten. Dekantieren Sie die Färbelösung aus dem Substratpellet. Resuspendieren Sie das Pellet gründlich in Typ-1-Wasser und zentrifugieren Sie es anschließend. Waschen Sie die farbstoffmarkierten Zellen drei- bis fünfmal auf diese Weise, um nicht-kovalent gebundenen löslichen Farbstoff von den Substraten zu entfernen.

Übertragen Sie für die abschließende Wäsche den Pelletanteil, der im Farbstofffreisetzungsassay verwendet wird, in 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Der Überstand der letzten Wäsche sollte klar sein, während der Untergrund blau bleibt. Lagern Sie das gefärbte Substrat suspendiert in einer minimalen Menge Wasser bei minus 20 Grad Celsius, bis es einsatzbereit ist.

Zur Vorbereitung des Farbstofffreisetzungsassays lassen Sie das gefrorene gefärbte Substrat auf Raumtemperatur zurückkehren und waschen Sie es zweimal mit dem Assay-Puffer, der empirisch für das Enzym bestimmt wurde. In diesem Fall kommt PBS zum Einsatz. Berechnen Sie das Volumen der benötigten Substratsuspension, indem Sie das Reaktionsvolumen von 200 Mikrolitern mit der Anzahl der durchzuführenden Farbstofffreisetzungsassays multiplizieren.

Um die Substratsuspension herzustellen, geben Sie zuerst das gefärbte Substrat in das entsprechende Volumen PBS. Führen Sie eine Eins-zu-Eins-Verdünnung durch und nehmen Sie eine erste Messung der optischen Dichte bei 595 Nanometern mit PBS als Blindwert vor. Geben Sie inkrementelle Mengen des gefärbten Substrats in die Suspension, bis eine optische Dichte von 2,0 bei 595 Nanometern erreicht ist.

In dieser Demonstration wird der Dye-Release-Assay verwendet, um die optimalen Inkubationsbedingungen für ein antimikrobielles Protein zu bestimmen. Bereiten Sie zunächst eine antimikrobielle Stammproteinsuspension her, indem Sie die Konzentration unter Verwendung von PBS auf 1 Milligramm pro Milliliter einstellen, wie im Protokolltext beschrieben. Verdünnen Sie dann die antimikrobielle Stammproteinsuspension auf eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter.

Diese Konzentration ergibt eine endgültige Reaktionsmasse von 1 Mikrogramm Protein pro Volumen, das der Assay-Reaktion zugesetzt wird. Die Reaktionsassays werden in 0,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen durchgeführt, um den zu beurteilenden thermischen Bereich zu bestimmen. Für jede thermische Bedingung werden 10 Mikroliter des Stammproteins zu 200 Mikrolitern der vorbereiteten Substratsuspension hinzugefügt.

Inkubieren Sie acht Stunden lang in einem Thermocycler, wobei Sie einmal pro Stunde durch Inversion mischen. Nach der Inkubation stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie 25 Mikroliter Ethanol in jedes Mikrofuge-Röhrchen geben. Um unverdautes unlösliches Substrat zu entfernen, zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 3.000 g g. Übertragen Sie danach 150 Mikroliter des Reaktionsüberstands für jedes Reaktionsgemisch auf eine 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden, wobei Sie darauf achten sollten, das Pellet des unverdauten Substrats nicht zu zerstören.

Um die enzymatische Aktivität zu quantifizieren, verwenden Sie ein Mikroplatten-Spektralphotometer, um die Absorption des Überstands bei 595 Nanometern zu messen. Die erhöhte Absorption durch den löslichen Farbstoff, der aus dem markierten Substrat in den Überstand freigesetzt wird, ist ein quantitatives Maß für die enzymatische Aktivität.