Ein Peg-Platten-Biofilm-Assay für das Screening antibakterieller Wirkstoffe

Nehmen Sie eine Mikrotiterplatte mit einem Deckel mit zylindrischen Stützen oder Stiften, die mit bakteriellen Biofilmen beschichtet sind.

Platzieren Sie den mit Biofilm beschichteten Stiftdeckel auf Mikrotiterplatten-Vertiefungen mit Puffer, um lose anhaftende oder planktonische Bakterien zu eliminieren, wobei der Schwerpunkt auf Biofilm-gebundenen Messungen liegt.

Übertragen Sie den gespülten, mit Biofilm beschichteten Stiftdeckel auf eine Challenge-Platte mit steigenden Konzentrationen des antibakteriellen Prüfmittels. Inkubieren ohne Schütteln.

Abhängig von der Konzentration und dem antibakteriellen Potenzial des Mittels stört es die bakterielle Stoffwechselaktivität und die Integrität des Biofilms.

Setzen Sie den Stiftdeckel nach der Inkubation auf pufferhaltige Plattenvertiefungen, um Planktonbakterien zu entfernen.

Übertragen Sie es in Mikrotiterplattenvertiefungen mit einem Biofilm-Rückgewinnungsmedium, das Resazurin, einen zelldurchlässigen, schwach fluoreszierenden Farbstoff, enthält. Ausbrüten.

In stoffwechselaktiven Bakterien reduzieren Dehydrogenase-Enzyme blau gefärbtes Resazurin in rosafarbenes, fluoreszierendes Resorufin.

Ein Mangel an Resazurin-Umwandlung deutet auf eine Biofilm-Deletion hin, während die Umwandlung in Resorufin auf das Vorhandensein lebensfähiger Zellen hindeutet.

Die niedrigste Konzentration des antibakteriellen Testmittels, die keine Resazurin-Umwandlung ergibt, bezeichnet die minimale Konzentration zur Beseitigung von Biofilmen.

Nehmen Sie eine frische 96-Well-Platte und geben Sie 100 Mikroliter CRPMI, äquilibriert auf Raumtemperatur, in jede Vertiefung der Reihen B bis H. Verdünnen Sie bis zu vier Testverbindungen separat in 1,0 Millilitern CRPMI auf das 2-fache der gewünschten Endkonzentration. Es werden 200 Mikroliter der Verbindung eins in den Vertiefungen A1 bis A3, 200 Mikroliter der Verbindung zwei in den Vertiefungen A4 bis A6, 200 Mikroliter der Verbindung drei in den Vertiefungen A7 bis A9 und 200 Mikroliter der Verbindung vier in den Vertiefungen A10 bis A12 hinzugefügt.

Verdünnen Sie die Testverbindungen seriell mit einer Mehrkanalpipette. Beginnen Sie damit, 100 Mikroliter von Reihe A nach Reihe B zu übertragen und zu mischen. Übertragen Sie auf diese Weise weiterhin 100 Mikroliter von gut zu gut. Nach jedem Transfer mischen und in Reihe F aufhören. Nach dem Mischen 100 Mikroliter aus Reihe F in einen Abfallbehälter ausstoßen. Füllen Sie keine Flüssigkeit in die Reihen G und H um. Geben Sie schließlich mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter CRPMI in jede Vertiefung der Platte, um das endgültige Volumen auf 200 Mikroliter zu bringen.

Geben Sie 200 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in eine frische sterile 96-Well-Platte, deren Vertiefungen mit den Abmessungen der Biofilm-Initiationsplatte identisch sind. Entfernen Sie anschließend die Plastiktüte und die Paraffinfolie von der inkubierten Biofilm-Initiationsplatte. Heben Sie den Deckel gerade nach oben und vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Stiften und dem Plattenboden, da dies den Biofilm beschädigen kann. Bewahren Sie den unteren Teil für die spätere Analyse des OD₆₀₀ auf.

Spülen Sie die planktonischen Zellen ab, indem Sie den Stiftdeckel auf die PBS-Platte legen. Tauchen Sie die Stifte 5 Sekunden lang ein, heben Sie sie aus dem PBS heraus und tauchen Sie erneut ein, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Stifte nicht gegen die Vertiefungsseiten schlagen. Setzen Sie den gespülten Stiftdeckel in die Herausforderungsplatte ein. Vermeiden Sie unnötigen Kontakt zwischen den Stiften und der Bodenplatte, da dies den Biofilm beschädigt und zu inkonsistenten Ergebnissen führt.

Verschließen Sie die Platte mit Paraffinfolie und legen Sie sie wie zuvor in eine verschließbare Plastiktüte. Inkubieren Sie die Platte ohne Schütteln für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Nehmen Sie den Boden der Biofilm-Initiationsplatte und resuspendieren Sie die Bakterien in jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette. Messen Sie den OD₆₀₀ mit einem geeigneten Mikroplatten-Reader, um das Wachstum in allen Vertiefungen zu bestätigen, aber die Sterilitätskontrollen in Reihe H.

Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, das mit einer Inkubationskammer ausgestattet ist und kinetische Fluoreszenzmessungen zum Nachweis der Resazurin-Umwandlung durchführen kann. Richten Sie eine 24-Stunden-Messung der kinetischen Fluoreszenz mit einer 530-Nanometer-Anregung und einer 590-Nanometer-Emission ein. Stellen Sie die Kammertemperatur auf 37 Grad Celsius ein und lassen Sie die Platte alle 20 Minuten ablesen.

Stellen Sie den Plattenleser so ein, dass er gemäß den Anweisungen des Herstellers von der Unterseite der Platte aus gemessen wird. Bereiten Sie das Waschen der Platte vor, indem Sie 200 Mikroliter PBS mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte geben. Bereiten Sie dann das Biofilm-Wiederherstellungsmedium vor, indem Sie 400 Mikroliter 0,8 Milligramm pro Milliliter Resazurin-Stammlösung zu 20 Millilitern CRPMI-Medium bis zu einer Endkonzentration von 16 Mikrogramm pro Milliliter Resazurin hinzufügen.

Geben Sie anschließend 150 Mikroliter Biofilm-Rückgewinnungsmedium mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer frischen 96-Well-Platte. Bringen Sie die Challenge-Platte aus dem Inkubator in eine Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und die Siegelfolie. Entfernen Sie den Stiftdeckel von der Challenge-Platte und spülen Sie die planktonischen Zellen in PBS wie zuvor ab, wobei Sie den Boden der Challenge-Platte für die nachfolgende OD_600-Analyse aufbewahren.

Setzen Sie nach dem Spülen den Stiftdeckel in den Plattenboden ein, der das Biofilm-Rückgewinnungsmedium enthält. Wickeln Sie die Seite der Platte mit Paraffinfolie ein und achten Sie darauf, den Boden der umlaufenden Vertiefungen nicht zu blockieren. Legen Sie die Platte unmittelbar nach dem Einwickeln auf den Plattenleser und starten Sie eine kinetische Messung über einen Zeitraum von 24 Stunden, indem Sie das zuvor erstellte kinetische Resazurin-Protokoll starten.