Eine immunhistochemische Färbung zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen

Beginnen Sie mit einem Objektträger, der einen mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten, mit Tollwutviren infizierten Schnitt aus dem Gehirngewebe der Maus enthält. Der fixierte Abschnitt hält virale Antigene durch Proteinvernetzung zurück.

Behandeln Sie den Objektträger mit einer Xylollösung, um das Paraffin zu entfernen.

Tauchen Sie den Objektträger in abnehmende Ethanolkonzentrationen, um das Gewebe zu rehydrieren und es mit wässrigen Lösungen kompatibel zu machen.

Einführung eines Protease-haltigen Puffers, um Proteinvernetzungen zu unterbrechen und die Zugänglichkeit des Antigens zu verbessern.

Tauchen Sie Wasserstoffperoxid ein, um endogene Peroxidasen zu blockieren, und tragen Sie eine Blockierungslösung auf, um unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern.

Einführung von Primärantikörpern, die spezifisch für das Tollwutantigen sind und Antigen-Antikörper-Komplexe bilden.

Fügen Sie biotinylierte Sekundärantikörper hinzu, die an die Primärantikörper binden. Inkubieren Sie mit Streptavidin-konjugierten Peroxidase-Enzymen, die mit Biotin interagieren.

Führen Sie ein Peroxidasesubstrat ein, wodurch ein magentaroter Niederschlag entsteht.

Färben Sie das Gewebe mit einer Kernfärbung, gefolgt von einem Bläuungsmittel, wodurch die Zellkerne blau gefärbt werden.

Das immunhistochemische Bild zeigt magenta-rote Flecken im Zytoplasma, was das Vorhandensein von Tollwutantigenen im Gewebeschnitt bestätigt.

Stelle mit einem Mikrotom einen 5-Mikrometer-Paraffinschnitt her. Schweben Sie den Abschnitt auf einem Wasserbad bei 38 Grad Celsius und sammeln Sie ihn auf Glasobjektträgern. Beschriften Sie die Objektträger mit einem reagenzienbeständigen Stift. Legen Sie die Objektträger auf ein Blech und schmelzen Sie sie eine Stunde lang im Ofen bei 55 bis 60 Grad Celsius.

Nehmen Sie dann die Objektträger aus dem Ofen und entparaffinieren Sie sie sofort mit drei aufeinanderfolgenden Xylolspülungen von jeweils fünf Minuten. Danach rehydrieren Sie die Abschnitte auf dem Objektträger durch sequentielles Eintauchen in abnehmende Verdünnungen von Ethanol zu deionisiertem Wasser, wie im Textprotokoll beschrieben.

Behandeln Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit der Protease zur proteolytischen Antigengewinnung, spülen Sie dann die Objektträger 10 Minuten lang in PBST und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit 3% Wasserstoffperoxid. Waschen Sie die Objektträger danach erneut 10 Minuten lang mit PBST.

Entfernen Sie zunächst einen Objektträger aus dem Puffer, achten Sie darauf, dass Sie jeweils nur einen Objektträger anfassen, während die anderen untergetaucht bleiben, und tupfen Sie mit einem Papiertuch den überschüssigen Puffer aus dem Bereich des Gewebeabschnitts ab. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit normalem Ziegenserum bei Raumtemperatur.

Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger in der Feuchtigkeitskammer mit dem optimalen vorgegebenen Verdünnungsprimär-Tollwut-Antikörper und den Negativkontroll-Antikörpern bei Raumtemperatur für 60 Minuten ohne Zwischenwäschen. Danach waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit PBST und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang in einer Feuchtigkeitskammer mit dem biotinylierten Antikörper bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Objektträger erneut 10 Minuten lang mit PBST. Inkubieren Sie die Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer mit Streptavidin-HRP-Komplex 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und waschen Sie den PBST 10 Minuten lang. Dann mit AEC in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubieren. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser und färben Sie sie zwei Minuten lang mit Gill's Hämatoxylin, verdünnt 1 bis 2 mit deionisiertem Wasser, gegen.

Spülen Sie danach das überschüssige Hämatoxylin ab, indem Sie die Objektträger in entionisiertem Wasser tauchen. Spülen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang in Scott's Leitungswasser ab und waschen Sie sie 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser. Entnehmen Sie die Dias nacheinander und montieren Sie sie mit wasserlöslichem Einbettmedium. Verwenden Sie dann ein Lichtmikroskop, um die Objektträger zu lesen.