Verwendung von DNA-basierten Zugsonden zur Bewertung der von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte

Beginnen Sie mit einem funktionalisierten Glasdeckglas mit Polyethylenglykol-verankerten Goldnanopartikeln.

DNA-Haarnadel-Zugsonden hinzufügen, die eine DNA-Haarnadel enthalten, die mit zwei Oligonukleotiden in gegenüberliegenden Armen hybridisiert ist.

Der Ligandenstrang enthält ein Fluorophor und Biotin, während der Ankerstrang einen Quencher und eine Thiolgruppe enthält. Bei diesem Aufbau unterdrückt der Quencher die Fluoreszenz.

Die DNA-Sonden binden an die Goldnanopartikel und verankern sich an dem Glasdeckglas.

Führen Sie Streptavidin ein, das mit den Biotinmolekülen der Ligandenstränge interagiert.

Fügen Sie biotinylierte Liganden hinzu, die an vorgebundene Streptavidin-Moleküle binden.

Überlagern Sie das Deckglas mit CD8-positiven T-Zellen; ihre Rezeptoren interagieren mit immobilisierten Liganden und bilden eine Rezeptor-Liganden-Interaktionsstelle.

Diese Wechselwirkung erzeugt eine Kraft, die die DNA-Haarnadelstruktur entfaltet, das Fluorophor vom Quencher trennt und die Fluoreszenzemission fördert.

Führen Sie nicht-fluoreszierende Locking-Stränge ein, die mit ungefalteten Segmenten der Sonden interagieren, um das Fluoreszenzsignal zu erhalten.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenz, um die von den Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte zu bewerten.

Legen Sie zunächst 25-Millimeter-Deckgläser auf ein Gestell aus Polytetrafluorethylen in einem 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie die Deckgläser dreimal aus, indem Sie sie in Wasser tauchen. Mischen Sie gleiche Mengen Ethanol und Wasser und geben Sie 40 Milliliter dieser Lösung in das Becherglas, das das Gestell und die Deckgläser enthält. Verschließen Sie dann das Becherglas mit Parafilm-Klebeband.

Reinigen Sie die Deckgläser, indem Sie das Becherglas 15 Minuten lang mit einem Ultraschallreiniger beschallen, und entsorgen Sie die Flüssigkeit nach der Beschallung. Spülen Sie dann das Becherglas mit dem Gestell und den Deckgläsern mindestens sechsmal mit Wasser aus, um alle verbleibenden organischen Lösungsmittel zu entfernen. Um eine frische Piranha-Lösung herzustellen, geben Sie 30 Milliliter Schwefelsäure in ein 50-Milliliter-Becherglas und fügen Sie langsam 10 Milliliter Wasserstoffperoxid hinzu. Mischen Sie die Piranha-Lösung vorsichtig mit dem Ende einer Glaspipette.

Um das Ätzen zu starten, übertragen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in das Becherglas mit der Piranha-Lösung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Deckgläser zu reinigen und zu hydroxylieren. Schieben Sie dann das Gestell mit einer Pinzette aus Stahl oder Polytetrafluorethylen in ein sauberes 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie es sechsmal mit Wasser ab. Um das Wasser vollständig zu entfernen, tauchen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in ein 50-Milliliter-Becherglas mit 40 Millilitern Ethanol und entsorgen Sie dann das Ethanol.

Tauchen Sie anschließend das Gestell 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 Milliliter Ethanol mit 3 % Aminopropyltriethoxysilan, um die Reaktion mit der Hydroxylgruppe auf den Deckgläsern zu initiieren. Spülen Sie die Oberfläche des Deckglases sechsmal ab, indem Sie sie in 40 Milliliter Ethanol tauchen, und trocknen Sie sie 20 Minuten lang bei 80 Grad Celsius im Ofen.

Decken Sie den inneren Boden der Petrischale mit Parafilmband ab, um zu verhindern, dass die Deckgläser in die Petrischale rutschen. Legen Sie dann die mit Amin bedeckten Deckgläser mit der zu funktionalisierenden Seite mit den DNA-Zugsonden nach oben. Decken Sie die Deckgläser für den späteren Gebrauch bei minus 20 Grad Celsius ab.

Um die Amingruppen auf den Deckgläsern zu verändern, fügen Sie Liponsäure-PEG-NHS und mPEG-NHS hinzu und inkubieren Sie die Petrischale 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Oberfläche am Ende der Inkubation dreimal mit Wasser ab. Danach werden 100 Mikroliter 0,1 molares Natriumbicarbonat mit 1 Milligramm Sulfo-NHS-Acetat in einen Satz Sandwich-Deckgläser gegeben und 30 Minuten lang inkubiert, damit die Passivierung stattfindet.

Geben Sie 0,5 Milliliter Goldnanopartikel zu jedem Deckglas und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Deckgläser nach der Inkubation dreimal mit Wasser ab. Nachdem Sie den Schwarze-Loch-Quencher 2-Strang in einem Verhältnis von 10 zu 1 zur geglühten DNA-Zugsonde hinzugefügt haben, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung pro zwei Deckgläser hinzu, um das Sandwich herzustellen.

Legen Sie vorsichtig eine nasse Labortaschentuchkugel in die Petrischale, weg von den Deckgläsern, und verschließen Sie die Schale mit Parafilm-Klebeband, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Decken Sie danach die Schale mit einer Folie ab und brüten Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius aus. Bauen Sie am nächsten Tag die Bildgebungskammer zusammen und achten Sie darauf, dass beim Festziehen der Kammer keine Risse an der Oberfläche entstehen. Geben Sie dann 0,5 bis 1 Milliliter Hanks ausgewogene Salzlösung in die Bildgebungskammer.

Verwenden Sie den Cy3B-Kanal mit einem 100-fachen Objektiv, um fluoreszierende Signale von Zellen zu erfassen, die auf die DNA-Haarnadel-Zugsonden aufgebracht werden, wenn sie sich auszubreiten beginnen. Nach der Aufbereitung von 100 mikromolaren nicht fluoreszierenden Locking-Strangs wird dieser zum gewünschten Zeitpunkt in einer Endkonzentration von 1 Mikromolar in der Bildgebungskammer zu den Zellen gegeben, um das Spannungssignal zu speichern, und durch Pipettieren mit den Zellen gemischt.

Nach etwa 10 Minuten Verriegelung können Sie Zeitrafferfilme oder Endpunktbilder in Epifluoreszenz sowohl für die qualitative Spannungskartierung als auch für die quantitative Analyse aufnehmen.