JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 Ansichten • 4:23 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit 3D-Sphäroid-Monokulturen von Lymphomzellen, krebsartigen weißen Blutkörperchen und Co-Kulturen von Lymphomen und neutrophilenähnlichen Zellen in einer Basalmembranmatrix.
Fügen Sie ein Testmedikament hinzu, das an intrazelluläres Tubulin bindet und die Mikrotubuli-Polymerisation stört, was zu einer zellulären Apoptose führt.
In der Co-Kultur werden durch direkten Kontakt mit Lymphomzellen die neutrophilenähnlichen Zellen aktiviert und die Zytokinsekretion induziert.
Diese Zytokine interagieren mit den Rezeptoren der Lymphomzellen, lösen nachgeschaltete Signalkaskaden aus und regulieren die Expression anti-apoptotischer Proteine hoch, wodurch das Überleben der Zellen gefördert wird.
Entsorgen Sie die Medien. Fügen Sie einen Dissoziationspuffer hinzu, um die Zelladhäsion zu unterbrechen.
Kratzen Sie die Sphäroide ab und brüten Sie sie unter Rührung aus. Die Suspension wird in Röhrchen überführt und weiter gerührt, um einzellige Suspensionen zu bilden.
Einführung eines Fluorophor-konjugierten Antikörpercocktails, der Lymphome und neutrophile Zellen markiert.
Fügen Sie Fluorophor-markiertes Annexin V und Propidiumiodid hinzu, um apoptotische und tote Zellen zu markieren.
Weisen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie ein erhöhtes Überleben der Lymphomzellen in der Co-Kultur nach, was auf einen neutrophilenvermittelten Schutz gegen das Medikament hinweist.
Um eine 3D-Co-Kultur einzurichten, fügen Sie allein 50.000 RL-Lymphom-B-Zellen hinzu oder mischen Sie sie mit HL60-differenzierten Zellen in sterilen 15-Milliliter-Röhrchen.
Schleudern Sie die Proben herunter und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern Basalmembranmatrix mit einer 1-Milliliter-Pipettenspitze, wobei die Öffnung auf 2 bis 3 Millimeter geschnitten ist. Inkubieren Sie anschließend 300 Mikroliter der Zellen in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.
Geben Sie am Ende der Inkubation 1 Milliliter des vollständigen RPMI-Mediums in jede Vertiefung und kehren Sie für weitere sieben Tage zu den 3D-Kulturen in den Inkubator zurück, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wird. An Tag 5 fügen Sie den Kulturen 10 nanomolare Vincristin hinzu.
Nach einer Woche Kultur aspirieren Sie das Medium und waschen Sie jede Welle 2 Mal mit 1 Milliliter eiskaltem PBS. Geben Sie dann 3 Milliliter eiskaltes PBS mit EDTA in jede Vertiefung und kratzen Sie den Boden der Vertiefungen mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab, um die Gele zu lösen. Schütteln Sie den Teller 30 Minuten lang vorsichtig auf Eis. Übertragen Sie dann die Zellsuspensionen in einzelne sterile 15-Milliliter-Röhrchen, um sie weitere 30 Minuten lang sanft auf Eis zu schütteln.
Bestätigen Sie das Erscheinungsbild einer homogenen Zellsuspension. Schleudern Sie dann die Zellen herunter, gefolgt von einer PBS-Wäsche, und resuspendieren Sie die Pellets in frischem PBS mit FBS. Markieren Sie schließlich die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern und Viabilitätsfarbstoffen, wie gerade gezeigt, und analysieren Sie die RL- und HL60-differenzierten Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der dargestellten Gating-Strategie.