TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Nehmen Sie eine polymerbeschichtete Glasbodenschale, an deren Oberfläche IgG-opsonisierte rote Blutkörperchen oder Erythrozyten haften.

Stellen Sie die Schale auf einen Tisch mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop und halten Sie ihn auf physiologischer Temperatur.

Fügen Sie Makrophagen hinzu, die fluoreszenzmarkierte zytoplasmatische Peptide enthalten, die an polymerisiertes Aktin binden und so die Visualisierung des Zytoskeletts erleichtern.

Richten Sie während der Bildgebung einen Laserstrahl in einem Winkel, der über dem kritischen Winkel liegt, was zu einer internen Reflexion und zur Erzeugung einer evaneszenten Welle am Kontaktpunkt führt.

Die evaneszenten Wellen beleuchten selektiv die Fluorophore an der Grenzfläche zwischen Glas und Probe und ermöglichen so eine Echtzeit-Visualisierung der Phagozytose.

Makrophagen-Fc-Rezeptoren binden an die IgG-opsonisierte Erythrozyten, was zu einer Rezeptorclusterbildung um die Kontaktfläche führt.

Clustering löst intrazelluläre Signalwege und GTPase-Aktivierung aus, was die Aktinpolymerisation und die Dynamin-Rekrutierung antreibt und Pseudopoden bildet.

Die Pseudopoden erstrecken sich um die Erythrozyten und bilden einen phagozytischen Becher.

Schließlich verschmelzen die Pseudopod-Spitzen. Das akkumulierte Dynamin vermittelt die Phagosomentrennung von der Zellmembran und internalisiert die opsonisierten Erythrozyten.

Für die nicht-kovalente Fixierung der SRBCs gießen Sie je 2 Milliliter der IgG-opsonisierten Zellen in jede der mit Polylysin beschichteten Schalen und zentrifugieren Sie die Proben in einer Schwingrotorzentrifuge. Entsorgen Sie die Überstände und waschen Sie die Partikel einmal mit 2 Millilitern PBS plus 10 % BSA.

Inkubieren Sie die Partikel dann mit 2 Millilitern frischem PBS plus 10 % BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Wäschen mit 2 Millilitern PBS. Ersetzen Sie das PBS nach dem letzten Waschen durch 2 Milliliter serumfreies Mikroskopiemedium mit 37 Grad Celsius.

Stellen Sie eine SRBC-codierte Schüssel auf den Mikroskoptisch. Kratzen Sie dann die transfizierten Zellen von Interesse vom Boden der Kulturschale ab und pipettieren Sie die Zellen einige Male, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Geben Sie die transfizierten Zellen in die SRBC-beschichtete Schale.

Starten Sie die Live-Erfassungssoftware. Finde eine Zelle, die die fluoreszenzmarkierten Proteine exprimiert, und passe die Position der Schale so an, dass sich eine Zelle von Interesse in der Mitte des Feldes befindet. Erfassen Sie 500 Bilder in verschiedenen Winkeln von 0 bis 5 Grad in Schritten von 0,01 Grad bei einer Anregungswellenlänge.

Um den kritischen Winkel zu bestimmen, bei dem das einfallende Licht an der Glas-Medium-Grenzfläche vollständig reflektiert wird und eine evaneszente Welle erzeugt, öffnen Sie die Bildsequenz in der entsprechenden Bildgebungssoftware. Wählen Sie einen interessierenden Bereich in der Zelle mit gleichmäßiger Fluoreszenz aus.

Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bild die Option Stapeln und Z-Achsen-Profil plotten. Um das Profil der Z-Achse darzustellen, wird die mittlere Fluoreszenzintensität, die im interessierenden Bereich gemessen wird, mit der Funktion der Winkel auf der X-Achse dargestellt. Jeder Winkelwert auf der x-Achse, der über dem kritischen Winkel liegt, kann dann während der Mikroskopiesitzung verwendet werden, um ein TIRF-Signal zu erhalten.