Ein In-vitro-Assay zur Bewertung des immunmodulatorischen Einflusses von Monozyten auf die Leukozytenproliferation

Nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit adhärenter mesenchymaler Stammzellkultur (MSC).

Fügen Sie mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) hinzu und inkubieren Sie.

MSCs sezernieren den Hepatozyten-Wachstumsfaktor, der Monozyten dazu veranlasst, einen immunmodulatorischen Phänotyp anzunehmen, der Interleukin-10 oder IL-10 produziert.

Den PBMC-haltigen Überstand in ein Röhrchen überführen.

Fügen Sie Antikörper-beschichtete magnetische Kügelchen hinzu, die an den Monozyten-Oberflächenmarker CD14 binden.

Verwenden Sie einen Magnetabscheider, um die CD14+-Monozyten zu isolieren, und geben Sie sie in zunehmender Konzentration in Multi-Well-Plattenvertiefungen.

Einführung von Fluoreszenzfarbstoff-CFSE-markierten Effektor-CD4+ T-Zellen.

Fügen Sie Antikörper-konjugierte Mikrokügelchen hinzu, die spezifisch an die T-Zell-Oberflächenmarker CD3 und CD28 binden und die Zellen aktivieren.

In den Kontrollmonozyten vermehren sich aktivierte T-Zellen, wobei jede Zellteilung die CFSE-Fluoreszenzintensität in den Tochterzellen verringert.

In Co-Kulturen sezernieren MSC-induzierte Monozyten jedoch IL-10 und unterdrücken so die Proliferation von Effektor-T-Zellen.

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie konnten weniger T-Zellen beobachtet werden, die mit zunehmender Monozytenkonzentration eine verringerte CFSE-Fluoreszenzintensität aufwiesen, was auf eine Unterdrückung der Effektor-T-Zellproliferation durch MSC-induzierte Monozyten hinweist.

Um einen Effektorsuppressionsassay durchzuführen, beginnen Sie mit der Einrichtung einer MSC-PBMC-Co-Kultur mit 2,5 x 10⁶ PBMCs, die mit 250.000 MSCs co-kultiviert wurden, um sicherzustellen, dass genügend MSC-co-kultivierte PBMCs für die Selektion der Subpopulation vorhanden sind.

Nach 48 bis 72 Stunden bei 37 Grad Celsius wählen Sie die MSC-induzierten immunmodulatorischen Leukozyten von Interesse mit den entsprechenden magnetischen Beads aus. Fügen Sie dann CFSE-markierte allogene CD4-positive T-Zellen in 1 Milliliter vollständigem Leukozytenmedium pro Vertiefung in verschiedenen experimentellen Verhältnissen hinzu.

Fügen Sie als Nächstes anti-CD3/28-konjugierte Mikrokügelchen in einem Verhältnis von 1 zu 1 Kügelchen zu Zellen hinzu, um die CD4-positiven T-Zellen zu stimulieren. Am dritten Tag der Co-Kultur ist die Proliferation der CFSE-markierten CD4-positiven T-Zellen durch Durchflusszytometrie zu beurteilen.