Name: IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Lernen Sie die IgY-Extraktion aus Hühnereidotter mittels Polyethylenglykol-Fällung für immunologische Forschung. Diese kostengünstige Methode liefert hochaktive Antikörper mit minimalem Aufwand.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert (Projekt BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und ich dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Wir danken B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) für hervorragende technische Unterstützung.

1. Protokoll - IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung Abb.. 1 zeigt eine schematische Darstellung des IgY-Extraktionsverfahren (siehe Tabelle 2). Das Protokoll wurde erstmals im Polson et al. 1980. Alle Schritte sollten unter Verwendung von Latex-Handschuhe werden. <ol><li> Die Eierschale ist sorgfältig geknackt und das Eigelb ist es, eine "Eidotter Löffel" übertragen, um so viel Eiweiß wie möglich zu entfernen. </li><li> Das Eigelb auf ein Filterpapier übertragen und gerollt, um restliche Eiklar zu entfernen, dann das Eigelb Haut mit einer Lanzette oder ein ähnliches Instrument (Pipettenspitze) geschnitten. Das Eigelb wird in eine 50 ml Tube gegossen und das Ei Volumen registriert ist (V1). </li><li> Zweimal das Eigelb Volumen von PBS ist mit dem Eigelb (ΣV1 + V2), danach 3,5% PEG 6000 (in Gramm, pulverisiert) des Gesamtvolumens gemischt zugegeben und gevortext, gefolgt von 10 min ins Rollen auf einer rollenden Mischer. Dieser Schritt der Extraktion trennt die Suspension in zwei Phasen. Eine Phase besteht aus "Eigelb Feststoffe und fetthaltigen Substanzen" (original Zitat von Polson et al. 1980) und eine wässrige Phase, die IgY und andere Proteine. </li><li> Die Röhrchen werden bei 4 ° C zentrifugiert für 20 min (10.000 rpm nach zu 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, Festwinkelrotor). Der Überstand (V3) wird durch ein Faltenfilter gegossen und in einen neuen Schlauch. </li><li> 8,5% PEG 6000 in Gramm (berechnet nach dem neuen Volume) sind in das Röhrchen gegeben, gevortext und rollte auf einem rollenden Mischer wie in Schritt 3. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4 mit dem Unterschied, dass der Überstand verworfen wird. </li><li> Das Pellet wird vorsichtig in 1 ml PBS durch ein Glas-Stick und dem Vortexer aufgelöst. PBS ist ein Endvolumen von 10 ml (V4) aufgenommen. Die Lösung wird mit 12% PEG 6000 (w / v, 1,2 Gramm) gemischt und wie in Schritt 3 (Wirbel, Walzen-Mischer). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 und lösen das Pellet vorsichtig in 800 ul PBS (Glas-Stick und Vortex). Warten Sie, bis die Luftblasen verschwinden und dann übertragen (Pipette) der Extrakt einer Dialyse Kapsel. Spülen Sie den Schlauch mit 400 ul PBS und fügen Sie die Lautstärke auf den Dialyse-Gerät (V5). (Zur Herstellung von Dialyse-Geräte und Membranen siehe Anhang.) </li><li> Der Extrakt wird über Nacht in 0,1% iger Kochsalzlösung (1.600 ml) dialysiert und vorsichtig durch einen Magnetrührer gerührt. Am nächsten Morgen ist die Kochsalzlösung durch PBS ersetzt und dialysiert für weitere drei Stunden. </li><li> Danach wird der IgY-Extrakt wird aus der Dialyse Kapsel mit einer Pipette gezogen und auf 2 ml Röhrchen. Das Endvolumen beträgt ca. 2 ml (V6). </li><li> Der Proteingehalt (mg / ml) der Proben wird photometrisch bei 280 nm (1:50 verdünnt mit PBS) gemessen und berechnet nach dem Lambert-Beer-Gesetz mit einem Extinktionskoeffizienten von 1,33 für IgY (siehe Abb.. 2), Abb. . 4 zeigt die Qualität der Vorbereitung (Reinheit und Erholung sind rund 80%). </li><li> Es ist ratsam, die Proben in Aliquots bei -20 ° C (nicht einfrieren die Proben bei -70 ° C). </li><li> Die Qualität der letzten Vorbereitungen wird durch einfache SDS-PAGE analysiert, wie in JoVE Protokoll beschrieben <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Appendix-vor Gebrauch der Dialyseschlauch in folgender Weise muss nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet werden: <ol><li> 20 Dialyseplätze Taschen sind in Stücke von 30 cm geschnitten und da in einem 2000 ml Becherglas. </li><li> 1.750 ml einer 5 mM EDTA-Lösung versetzt. </li><li> Ein Glastrichter über dem Beutel gelegt, um sicherzustellen, dass die Beutel von der EDTA-Lösung bedeckt sind. Die Lösung wird erhitzt und für 5 min gekocht (Heizplatte). Die Lösung wird dekantiert und die Taschen sind dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. </li><li> Noch einmal 1.750 ml EDTA-Lösung versetzt, für 5 min gekocht und dreimal mit destilliertem Wasser wie oben. </li><li> Schließlich wird die Dialyse-Taschen sind für 10 min in destilliertem Wasser gekocht und bei 4 ° C. Nehmen Sie die Dialysebeutel durch sterilisierte Pinzette. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der IgY-Extraktion mittels Polyethylenglykol Niederschläge nach der ursprünglichen Beschreibung der Polson et al. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Um eine größere Ansicht klicken Sie hier.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Entwicklung der Gesamt-IgY im Eidotter immunisierter Hühner in Abhängigkeit vom Alter. Da ist der wöchentliche Mittelwert der insgesamt IgY / Ei-und SD (n = 4 Legehennen). Von [Pauly et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Laying Kapazität Überwachung von vier Hennen mit verschiedenen Antigenen immunisiert. Die Pfeile zeigen die Immunisierung Datum (aus [Pauly et al. 2009]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Um ein größeres Bild hier klicken Ansicht.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese einzelner IgY-Präparationen aus verschiedenen Eiern unter reduzierenden Bedingungen Lane 1 - Molekulargewichtsmarker, Spur 2 - IgY-Standard, Lane 3-5 - verschiedene IgY Proben hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Dies sind die letzten Vorbereitungen nach 10 des Protokolls Schritt. HC - schwere Ketten, LC - Licht chaines,? - Geringfügige Verunreinigungen entsprechend Molekulargewicht ca. 35 kDa (wahrscheinlich die C-terminale Fragment von Vitellogenin II-Vorstufe [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> Huhn 21 (Antigen A) </td><td> Huhn 22 (Antigen A) </td><td> Huhn 19 (Antigen B) </td><td> Huhn 23 (Antigen C) </td></tr><tr><td> Egg (Gesamtzahl IgY) 1, 2-Jahres-Zeitraum </td><td> 625 (38 g) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 g) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Egg (Gesamtzahl IgY), im ersten Jahr </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 g) </td><td> 308 (17 g) </td></tr><tr><td> Egg (Gesamtzahl IgY), zweites Jahr </td><td> 280 (18 g) </td><td> 322 (21 g) </td><td> 219 (15 g) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Der max. möglichen Keim-Nummer (erstes Jahr) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Der max. möglichen Keim-Nummer (zweites Jahr) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> Anzahl der verarbeiteten Eier </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 Die Höhe der insgesamt IgY wird durch Multiplikation der Zahl der Eier durch einen mittleren Wert von 60 mg Protein pro Ei nach den Angaben in Abbildung 2 berechnet. 2 Die max. möglichen Keim-Anzahl pro Jahr liegt bei 325 nach einer Information des Züchters. Tabelle 1. Zwei Jahre Statistik der Eiablage Kapazität von Hühnern, die mit verschiedenen Antigenen immunisiert. Legen Kapazität in Prozent der maximal vier Hennen nach Immunisierung mit verschiedenen Antigenen sowie die IgY-Ergebnis innerhalb von zwei Jahren (siehe auch Abb.. 3), [Pauly et al. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> Egg Nr. </td><td> Hen Nr. Legedatum </td><td> V1 [ml] Eigelb </td><td> V2 [ml] PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> Vol [ml] nach </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> Pellet </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> Pellet </td><td> Vol [ml] </td><td> Insgesamt Protein mg / ml </td><td> Korrigierte gesamten Proteins mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec., centrif. und Filtration V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> gelöst in ml PBS V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> Gelöst in ml PBS V5 </td><td> Nach der Dialyse gegen PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1,33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1,58 </td><td> 31 </td><td> 2,63 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 35,0 </td><td> 26,3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1,37 </td><td> 25 </td><td> 2,12 </td><td> 10 </td><td> 1,2 </td><td> 1,2 </td><td> 1,7 </td><td> 28,8 </td><td> 21,6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Beispielhafte Protokoll der PEG-Fällung

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her, indem Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03) eingestellt durchgeführt.

Die Wahl eines geeigneten IgY Reinigungsverfahren ist nach Skala der Reinigung (Labor oder Industrie), Wirtschaftlichkeit, Technik (Laborausstattung) und Auswirkungen auf die Umwelt (Abfallwirtschaft) beeinflusst. Verschiedene IgY Extraktionsmethoden wurden im Detail durch De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, zur Überprüfung siehe auch Schade et al. 2005) überprüft. Im Allgemeinen können diese Methoden in drei Hauptgruppen eingeteilt werden: <ol><li> Niederschlag Methoden: mit Ammonium-oder Natriumsulfat, Polyethylenglykol (PEG), Caprylsäure und caragenean. </li><li> Chromatographische Methoden: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, thiophylic Interaktionschromatographie und Gelfiltration gereinigt. </li><li> Ultrafiltration. </li></ol> Die Reinheit eines IgY Vorbereitung kann durch eine Kombination von Methoden erhöht werden, z. B. PEG-Fällung mit Affinitätschromatographie kombiniert werden. In einigen Fällen, abhängig von der endgültigen Anwendung wird ein wässriger Extrakt der IgY ausreichend, um gute Ergebnisse (Akita &amp; Nakai 1993) zu erreichen. Nach unserer Erfahrung, arbeiteten die IgY-Probe, die wir durch PEG-Fällung erhalten sehr gut in vielen verschiedenen immunologischen Tests. Durch die Standardisierung der PEG-Fällungsverfahren eine technische Assistentin in der Lage, ungefähr 84 Eier pro Woche, was zu einem Betrag von insgesamt IgY zwischen 4 und 7 g pro Woche entspricht Prozess. Eine einfache Rechnung: Eine Legehenne ist mit einem Antigen immunisiert. Nach ein paar steigern Impfungen die Henne produziert spezifische Antikörper (Ab) mit einem Titer von 1:50.000 in einem Zeitraum von 30 Tagen. 30 Eier x 2 ml IgY-Extrakt (siehe Protokoll und Bild. 3) entspricht 60 ml insgesamt IgY, was wiederum entspricht einer Ab-Verdünnung von 3.000 l (die Kapazität einer Schaufel 10 l), die mit 3.000 l bedeutet von Ab Lösung 300 Eimer gefüllt werden kann. Also, im Hinblick auf so große Ab-Menge ist es kein Problem, eine Ab-Pool von konstanter Qualität und Spezifität zu speichern. Diese Technik reduziert die Lade / viel Variabilität sonst in polyspezifischen Ab beobachtet. Trotz der Aspekt der Quantität haben IgY Ab weitere Vorteile im Vergleich zu Säugetieren IgG: Keine Aktivierung von Säugetier-Komplement-System, keine Kreuzreaktivität mit HAMA (human anti-Maus-Antikörper), Rheumafaktoren oder menschlichen Blutgruppen-Antigene (fehlende heteroagglutinins). Ein herausragender Vorteil der IgY-Ab ist die sogenannte phylogenetische Distanz. Phylogenetische Distanz ist der Grund für die häufig beschriebenen Unterschiede zwischen den Ab Besonderheiten von Säugetieren und Geflügel, auch wenn identisch immunisiert. Neben den Unterschieden zwischen den Säugetieren und die Vogelgrippe Immunsystem selbst trägt Unterschiede in stammesgeschichtlichen Entwicklung in diesen beiden Tierklassen auf die verschiedenen Ab Besonderheiten. Mehrere Autoren haben berichtet, dass Hühner produzieren häufig Abs gegen phylogenetisch hochkonservierte Säugetieren gewonnenen Proteinen oder Peptiden effizienter als die Kaninchen (für eine Übersicht siehe Schade et a. 2005). Als Folge davon kann eine konservierte Antigen bleiben &quot;maskiert&quot;, um das Kaninchen Immunsystem und verursachen so nur einen schwachen oder eine &quot;stille&quot; Antwort. Außerdem, wenn Hühner und Kaninchen mit der gleichen Säugetieren Antigen immunisiert, sehr oft die Hühner mit einem Ab-Spezifität, die nur selten bei Kaninchen erzielt werden können reagieren. Auch der Aspekt des Tierschutzes ist wichtig, da die Ab non-invasiv werden extrahiert aus Eigelb. In Kombination mit Gene-Gun (Plasmid) Immunisierung der IgY-Produktion ist komplett nicht-invasive (Witkowski et al. 2009). Im Ergebnis ist die Herstellung von Ab in Hennen und die IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung sehr kostengünstig und führt zu sehr spezifischen Ab mit stabilen Titer von bis zu 1:1.000.000. Aufgrund der phylogenetischen Abstand zwischen Aves und Mammalia sind Hühner in der Lage, spezifische Ak gegen hochkonservierte Säugetieren Antigene im Gegensatz zu zB Kaninchen zu produzieren. Die außergewöhnliche Höhe der Ab durch IgY-Technologie erhalten die Tür öffnet auch für den Einsatz von IgY-Ab in Human-und Veterinärmedizin zu therapeutischen / prophylaktischen Zwecken.

<ol><li> Dialyse Bag Visking, Typ 27/32, ab -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland geschnitten </li><li> Falcon-Röhrchen Blue Max, 50 ml Polypropylen konisches Röhrchen, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA </li><li> Faltenfilter MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Heraeus </li><li> Magnetrührer, Variomag Mono, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Deutschland </li><li> Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Deutschland </li><li> Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Deutschland </li><li> Polyethylenglykol 6000, Rotipuran Ph.Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland </li><li> Premixed PBS-Puffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland </li><li> Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK </li><li> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i. Br., Deutschland </li><li> Yolk Löffel, Fackelmann (houshold Effekte), Deutschland </li></ol>

igy-technologie: extraction of chicken antikörper aus eidotter durch polyethylenglykol (peg) niederschlag

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens kann durch im Impfung (Musculus pectoralis, links und rechts, Injektionsvolumen 0,5-1,0 ml) oder mit Hilfe von Gene-Gun-Plasmid-Immunisierung immunisiert werden. Abhängig von der Immunogenität des Antigens, hohe Antikörper-Titer (bis 1:100.000 - 1:1.000.000) kann nach nur einem oder 3 erreicht werden - 4 steigern Impfungen. Normalerweise legt eine Henne Eier kontinuierlich für etwa 72 Wochen, danach wird die Legeleistung sinkt. Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion von insgesamt IgY aus Eigelb durch ein Niederschlag Verfahren (PEG. Polson et al. 1980). Das Verfahren beinhaltet zwei wichtige Schritte. Die erste ist die Entfernung von Lipiden und das zweite ist die Fällung von insgesamt IgY aus dem Überstand von step one. Nach der Dialyse gegen einen Puffer (in der Regel PBS) der IgY-Extrakt kann bei -20 ° C für mehr als ein Jahr gelagert werden. Die Reinheit des Extraktes beträgt rund 80%, variiert die Summe IgY pro Ei 40 bis 80 mg, abhängig vom Alter der Legehennen. Der gesamte Inhalt IgY steigt mit dem Alter der Henne von rund 40 mg / Ei bis zu 80 mg / Ei (über PEG-Fällung). Die Legeleistung einer Henne pro Jahr rund 325 Eier. Das bedeutet insgesamt möglichen Ernte von 20 g insgesamt IgY / Jahr bezogen auf eine mittlere IgY-Gehalt von 60 mg insgesamt IgY / Ei (siehe Tabelle 1).

Dieses Protokoll beschreibt insbesondere die Extraktion der Gesamt-IgY aus Eigelb mittels Polyethylenglykol Niederschlag und gibt allgemeine Informationen über IgY-Technologie.

IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

Hennen können durch i.m. Impfung (Musculus pectoralis, links und rechts, Injektionsvolumen 0,5–1,0 ml) oder mittels Gene-Gun immunisiert werden ...

In diesem Video wird die Isolierung von IGY-Antikörpern aus Hühnern gezeigt, die entweder mit dem Gen-Gummi, einem Plasmid oder auf traditionellere Weise mittels intramuskulärer Injektion immunisiert werden können. Zuerst wird das Eigelb isoliert. Anschließend werden die Lipide präzipitiert, gefolgt von einer Präzipitation eines Proteinfractions, das die Antikörper enthält, welche in einem weiteren Präzipitationsschritt isoliert werden.Schließlich werden die Antikörper gegen PBS dialysiert. Ja. Hallo. Mein Name ist Ard. Das ist meine Kollegin, die Adema, und wir arbeiten hier am sehr alten und berühmten Institut für Pharmakologie, das zur Medizin der SHA-Universität Berlin gehört.Im Folgenden möchten wir Ihnen die Extraktion von IGY aus Hühnerei, Joghurt und anderen Quellen vorstellen, und zwar mit einer sehr einfachen und außerdem sehr kostengünstigen Methode. Insgesamt gehören diese Verfahren zur sogenannten IGY-Technologie. Der erste Schritt bei der IGY-Gewinnung ist die Isolierung des Eigelbs.Für dieses Verfahren benötigen wir Reagenzglasgestelle, blaue Deckel, Filterpapier, Pipettenspitzenpuffer, einen Glasbecher, einen Löffel zur Trennung des Eigelbs vom Eiweiß und natürlich die Eier. Das Ei wird über dem Eigelblöffel geöffnet, um das Eiweiß ablaufen zu lassen. Anschließend wird der Löffel mit dem Eigelb vorsichtig bewegt, um den größten Teil des Eiweißes zu entfernen.Das Eigelb wird anschließend auf Filterpapier überführt, um Eiweißproteine so vollständig wie möglich zu entfernen. Die Eierschale ist in Eiern, die nicht länger als einen Monat gelagert wurden, sehr stabil; bei längerer Lagerung als drei Monate hingegen nicht. Die Eigelbschale kann während des Rollens auf Filterpapier aufgrund des Alterungsprozesses reißen.Anschließend wird die Dotterhaut mit einer Pipettenspitze geöffnet und in ein Reagenzglas überführt. Schließlich sieht man, dass der Dotter ein Volumen von etwa 15 Milliliter aufweist. Dieses Volumen ist normal für eine adulte Legehenne und variiert nur minimal.Das Eidottervolumen wird aufgezeichnet. 3,5 % Polyethylenglykol wird als Präzipitationsmittel in PBS-Puffer verwendet, um die Dotterproteine, einschließlich IGY, von den Fetten im Eigelb zu trennen. 1,58 Gramm Polyethylenglykol, was 3,5 % des endgültigen Dotter- und Puffervolumens entspricht, werden auf einer Waage abgewogen. Die 15 Milliliter Eigelb werden mit der doppelten Menge PBS-Puffer vermischt, daher werden 30 Milliliter PBS zu einem Endvolumen von 45 Millilitern hinzugefügt. Anschließend wird das Polyethylenglykol der Mischung zugegeben.Das Gefäß wird verschlossen und anschließend 20 bis 30 Sekunden gründlich im Vortex gemischt. Dabei das Gefäß periodisch umdrehen. Während des Vortexvorgangs.Nach dem Vortexen sollte das Eigelb vollständig suspendiert sein. Die Röhrchen werden nun 10 Minuten lang auf einen Rollmixer gestellt. Das Ergebnis ist eine homogene Mischung, deren Farbe sich von gelb zu hellgelb verändert hat.Jetzt wird die Mischung 20 Minuten lang zentrifugiert. Die Zentrifugation trennt einen klaren Überstand, der IGY und andere Proteine enthält, von einem gelben Präzipitat, das hauptsächlich aus Lipiden besteht. Im nächsten Schritt wird der Überstand durch einen gefalteten Filter abgegossen und in ein neues Gefäß übertragen.Das neue Volumen wird aufgezeichnet und der Niederschlag verworfen. Nun wird erneut Polyethylenglykol zum Überstand in einer Endkonzentration von 12 % zugegeben. Das bedeutet 3,5 % bei der ersten Fällung plus 8,5 % des resultierenden Überstandsvolumens, was insgesamt 12 % ergibt. Danach wird die Lösung wie zuvor auf einem Rollmixer gerührt, inkubiert und 20 Minuten lang zentrifugiert. Nun fällt das Polyethylenglykol das IgY und andere Proteine aus.Nach diesem Zentrifugationsschritt wird das Pellet zur Auflösung verwendet. Die Pellet-Glasstäbchen werden mit 70 % Ethanol desinfiziert, während die Stäbchen trocknen; der S-Supernatant wird verworfen. Das Gefäß wird anschließend umgedreht, um den letzten Rest des Supernatants ablaufen zu lassen.Ein Milliliter PBS wird anschließend zum Pellet gegeben. Der Pellet wird unter gründlichem Vortexen mit dem Glasstäbchen aufgelöst. Nun sieht man eine leicht gelbliche Lösung.Nun wird PBS auf ein Endvolumen von 10 Milliliter ergänzt, gefolgt von einer dritten Polyethylenglykol-Fällung in einer Konzentration von 12 % wie zuvor im Gegensatz zur zweiten Zentrifugation. Dieses Mal erhält man nach einer Zentrifugation von 20 Minuten ein weißes Präzipitat. Der Pellet wird auf die gleiche Weise wie zuvor, jedoch in zwei Schritten, gelöst.Im ersten Schritt wird es in 0,8 Milliliter PBS gelöst und in eine Mikrodialysiskapsel überführt. Anschließend wird das Gefäß mit weiteren 0,4 Milliliter PBS gespült, die ebenfalls in die Kapsel gegeben werden. Im nächsten Schritt wird ein Dialysebeutel mit desinfizierten Scheren zugeschnitten und mit destilliertem Wasser gespült.Der Dialyseschlauch wird anschließend auf den unteren Teil der Kapsel platziert und durch den oberen Teil fest verschlossen. Abschließend werden die Kapseln in einen Glasbecher überführt, der auf einem magnetischen Rührer steht. Die IGY-Lösung wird über Nacht gegen 0,1 % Salzlösung dialysiert.Am nächsten Tag wird die IGY-Lösung drei Stunden lang gegen PBS dialysiert. Nach Beendigung der Dialyse wird die Dialyseschlauche mit einer Pipettenspitze angebohrt und die IGY-Lösung entfernt und in ein kleines Gefäß überführt. Das Endvolumen wird aufgezeichnet.Das Endprodukt ist eine klare Lösung, die bei minus 20 Grad Celsius mehrere Jahre lang gelagert werden kann. Nach unserer Erfahrung sollte die IGY-Präparation nicht bei minus 70 Grad Celsius aufbewahrt werden, da wir einen erheblichen Aktivitätsverlust bei dieser Temperatur beobachtet haben. Nun, ich hoffe, wir konnten Sie davon überzeugen, dass die IDY-Extraktion aus a eine wirklich einfache und effektive Methode ist, wenn man unserem Protokoll folgt.Die benötigte Ausrüstung ist minimal, und wir sind der Überzeugung, dass ein gutes Verhältnis zwischen Aufwand und Nutzen besteht. Ich hoffe, dass Sie diese Videoveröffentlichung dazu anregt, unseren Protokollansatz und die Technologie ebenso wie ich gut zu nutzen. Vielen Dank.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Antikörper-basierte Immunpräzipitation von Phosphopeptiden aus einer Peptidmischung. Die angereicherten Phosphopeptide werden vakuumkonzentriert und für die nachgelagerte Analyse gelagert.

Phosphopeptid-Anreicherung: Eine Antikörper-basierte Immunpräzipitationstechnik zur Trennung spezifischer phosphorylierter Peptide aus komplexen Peptidmischungen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern aus Zellkulturflüssigkeit, die aus Eierstockzellen des chinesischen Hamsters gewonnen wurde. Es verwendet ein poröses Glasharz mit immobilisiertem Protein A, das an die Fc-Region der Antikörper in der Probe bindet und sie so effektiv von Verunreinigungen trennt. Die Verwendung eines Elutionspuffers mit niedrigem pH-Wert schwächt die Wechselwirkung und erleichtert die Gewinnung von gereinigten Antikörpern.

Eine Technik zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper, die von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters produziert werden

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Die Methode der Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) wurde ausgiebig verwendet, um native Komplexe aus zellulärem Extrakt, hauptsächlich eukaryotisch, für die Proteomik zu isolieren. Hier stellen wir ein TAP-Methodenprotokoll vor, das für die Aufreinigung von nativen Komplexen für Strukturstudien optimiert ist.

Reinigung von nativem Komplexe für die Strukturstudie ein Tandem Affinity Tag-Methode unter Einsatz

Diese Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere Staphylococcus aureus. Um dies zu erreichen, werden Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb und anschließende Fettsäureprofilierung von bakteriellen Phospholipiden unter Verwendung der Massenspektrometrie beschrieben.

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Dieser Artikel berichtet über eine einfache Methode, um die äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer von Hühnereiern zu isolieren und gleichzeitig strukturelle Veränderungen zu minimieren und die Proteinlöslichkeit jeder Subschicht für proteomische Analysen zu optimieren.

Mechanische Trennung und Proteinlöslichkeit der äußeren und inneren Perivitelline-Sublayer aus Henneneiern

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Herstellung von Latexkügelchen für Assays mit IgY-Antikörpern für den Antigennachweis.

Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Aufklärung der Funktion von Zielproteinen, und die Co-Immunpräzipitation (co-IP) kann PPIs leicht bestätigen. Wir transfizierten transient ein Plasmid, das für ein Epitop-markiertes Protein kodiert, in HEK-293-Zellen und entwickelten eine Immunpräzipitationsmethode, um die Bindung von zwei Zielproteinen einfach zu bestätigen.

Immunpräzipitation mit einem Anti-Epitop-Tag-Affinitätsgel zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Lernen Sie die IgY-Extraktion aus Hühnereidotter mittels Polyethylenglykol-Fällung für immunologische Forschung. Diese kostengünstige Methode liefert hochaktive Antikörper mit minimalem Aufwand.

IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

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