IgY-Technologie: Extraction of Chicken Antikörper aus Eidotter durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

In diesem Video wird die Isolierung von IGY-Antikörpern aus Hühnern gezeigt, die entweder mit dem Gen-Gummi, einem Plasmid oder auf traditionellere Weise mittels intramuskulärer Injektion immunisiert werden können. Zuerst wird das Eigelb isoliert. Anschließend werden die Lipide präzipitiert, gefolgt von einer Präzipitation eines Proteinfractions, das die Antikörper enthält, welche in einem weiteren Präzipitationsschritt isoliert werden.

Schließlich werden die Antikörper gegen PBS dialysiert. Ja. Hallo. Mein Name ist Ard. Das ist meine Kollegin, die Adema, und wir arbeiten hier am sehr alten und berühmten Institut für Pharmakologie, das zur Medizin der SHA-Universität Berlin gehört.

Im Folgenden möchten wir Ihnen die Extraktion von IGY aus Hühnerei, Joghurt und anderen Quellen vorstellen, und zwar mit einer sehr einfachen und außerdem sehr kostengünstigen Methode. Insgesamt gehören diese Verfahren zur sogenannten IGY-Technologie. Der erste Schritt bei der IGY-Gewinnung ist die Isolierung des Eigelbs.

Für dieses Verfahren benötigen wir Reagenzglasgestelle, blaue Deckel, Filterpapier, Pipettenspitzenpuffer, einen Glasbecher, einen Löffel zur Trennung des Eigelbs vom Eiweiß und natürlich die Eier. Das Ei wird über dem Eigelblöffel geöffnet, um das Eiweiß ablaufen zu lassen. Anschließend wird der Löffel mit dem Eigelb vorsichtig bewegt, um den größten Teil des Eiweißes zu entfernen.

Das Eigelb wird anschließend auf Filterpapier überführt, um Eiweißproteine so vollständig wie möglich zu entfernen. Die Eierschale ist in Eiern, die nicht länger als einen Monat gelagert wurden, sehr stabil; bei längerer Lagerung als drei Monate hingegen nicht. Die Eigelbschale kann während des Rollens auf Filterpapier aufgrund des Alterungsprozesses reißen.

Anschließend wird die Dotterhaut mit einer Pipettenspitze geöffnet und in ein Reagenzglas überführt. Schließlich sieht man, dass der Dotter ein Volumen von etwa 15 Milliliter aufweist. Dieses Volumen ist normal für eine adulte Legehenne und variiert nur minimal.

Das Eidottervolumen wird aufgezeichnet. 3,5 % Polyethylenglykol wird als Präzipitationsmittel in PBS-Puffer verwendet, um die Dotterproteine, einschließlich IGY, von den Fetten im Eigelb zu trennen. 1,58 Gramm Polyethylenglykol, was 3,5 % des endgültigen Dotter- und Puffervolumens entspricht, werden auf einer Waage abgewogen. Die 15 Milliliter Eigelb werden mit der doppelten Menge PBS-Puffer vermischt, daher werden 30 Milliliter PBS zu einem Endvolumen von 45 Millilitern hinzugefügt. Anschließend wird das Polyethylenglykol der Mischung zugegeben.

Das Gefäß wird verschlossen und anschließend 20 bis 30 Sekunden gründlich im Vortex gemischt. Dabei das Gefäß periodisch umdrehen. Während des Vortexvorgangs.

Nach dem Vortexen sollte das Eigelb vollständig suspendiert sein. Die Röhrchen werden nun 10 Minuten lang auf einen Rollmixer gestellt. Das Ergebnis ist eine homogene Mischung, deren Farbe sich von gelb zu hellgelb verändert hat.

Jetzt wird die Mischung 20 Minuten lang zentrifugiert. Die Zentrifugation trennt einen klaren Überstand, der IGY und andere Proteine enthält, von einem gelben Präzipitat, das hauptsächlich aus Lipiden besteht. Im nächsten Schritt wird der Überstand durch einen gefalteten Filter abgegossen und in ein neues Gefäß übertragen.

Das neue Volumen wird aufgezeichnet und der Niederschlag verworfen. Nun wird erneut Polyethylenglykol zum Überstand in einer Endkonzentration von 12 % zugegeben. Das bedeutet 3,5 % bei der ersten Fällung plus 8,5 % des resultierenden Überstandsvolumens, was insgesamt 12 % ergibt. Danach wird die Lösung wie zuvor auf einem Rollmixer gerührt, inkubiert und 20 Minuten lang zentrifugiert. Nun fällt das Polyethylenglykol das IgY und andere Proteine aus.

Nach diesem Zentrifugationsschritt wird das Pellet zur Auflösung verwendet. Die Pellet-Glasstäbchen werden mit 70 % Ethanol desinfiziert, während die Stäbchen trocknen; der S-Supernatant wird verworfen. Das Gefäß wird anschließend umgedreht, um den letzten Rest des Supernatants ablaufen zu lassen.

Ein Milliliter PBS wird anschließend zum Pellet gegeben. Der Pellet wird unter gründlichem Vortexen mit dem Glasstäbchen aufgelöst. Nun sieht man eine leicht gelbliche Lösung.

Nun wird PBS auf ein Endvolumen von 10 Milliliter ergänzt, gefolgt von einer dritten Polyethylenglykol-Fällung in einer Konzentration von 12 % wie zuvor im Gegensatz zur zweiten Zentrifugation. Dieses Mal erhält man nach einer Zentrifugation von 20 Minuten ein weißes Präzipitat. Der Pellet wird auf die gleiche Weise wie zuvor, jedoch in zwei Schritten, gelöst.

Im ersten Schritt wird es in 0,8 Milliliter PBS gelöst und in eine Mikrodialysiskapsel überführt. Anschließend wird das Gefäß mit weiteren 0,4 Milliliter PBS gespült, die ebenfalls in die Kapsel gegeben werden. Im nächsten Schritt wird ein Dialysebeutel mit desinfizierten Scheren zugeschnitten und mit destilliertem Wasser gespült.

Der Dialyseschlauch wird anschließend auf den unteren Teil der Kapsel platziert und durch den oberen Teil fest verschlossen. Abschließend werden die Kapseln in einen Glasbecher überführt, der auf einem magnetischen Rührer steht. Die IGY-Lösung wird über Nacht gegen 0,1 % Salzlösung dialysiert.

Am nächsten Tag wird die IGY-Lösung drei Stunden lang gegen PBS dialysiert. Nach Beendigung der Dialyse wird die Dialyseschlauche mit einer Pipettenspitze angebohrt und die IGY-Lösung entfernt und in ein kleines Gefäß überführt. Das Endvolumen wird aufgezeichnet.

Das Endprodukt ist eine klare Lösung, die bei minus 20 Grad Celsius mehrere Jahre lang gelagert werden kann. Nach unserer Erfahrung sollte die IGY-Präparation nicht bei minus 70 Grad Celsius aufbewahrt werden, da wir einen erheblichen Aktivitätsverlust bei dieser Temperatur beobachtet haben. Nun, ich hoffe, wir konnten Sie davon überzeugen, dass die IDY-Extraktion aus a eine wirklich einfache und effektive Methode ist, wenn man unserem Protokoll folgt.

Die benötigte Ausrüstung ist minimal, und wir sind der Überzeugung, dass ein gutes Verhältnis zwischen Aufwand und Nutzen besteht. Ich hoffe, dass Sie diese Videoveröffentlichung dazu anregt, unseren Protokollansatz und die Technologie ebenso wie ich gut zu nutzen. Vielen Dank.