Ein Verfahren zur Probenvorbereitung zur Visualisierung von Biofilm-bildenden Bakterien auf Pilzhyphen

Führen Sie eine zellophangebundene Pilzkolonie in eine fluoreszenzmarkierte Bakteriensuspension ein. Entfernen Sie das Zellophan und inkubieren Sie.

Die Bakterienzellen heften sich über Oberflächenmoleküle und Rezeptoren an die Pilzoberfläche. Die anhaftenden Bakterien sezernieren extrazelluläre polymere Substanzen, die aus Polysacchariden, Proteinen und DNA bestehen, die Bakterienzellen einfangen und die strukturelle Grundlage des Biofilms bilden.

Spülen Sie den Abschnitt in einer starken Salzlösung ab, um lose gebundene Bakterien zu entfernen

Schneiden Sie in einem Phosphatpuffer einen Teil des Volkes ab.

Übertragen Sie den Schnitt in steriles Wasser, das Weizenkeimagglutinin oder WGA enthält, das an einen roten Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist.

WGA, ein pflanzliches Protein, bindet an N-Acetylglucosamin- und Sialinsäurereste, wodurch der angehängte Farbstoff an der Zellwand des Pilzes fluoreszieren kann.

Spülen Sie den Abschnitt mit einem Phosphatpuffer ab.

Tauchen Sie eine Folie teilweise in den Puffer ein. Lassen Sie den Abschnitt darauf schweben. Heben Sie den Abschnitt vorsichtig an, damit er sich absetzt, ohne dass der Biofilm gestört wird.

Legen Sie ein Eindeckmedium an, gefolgt von einem Deckglas für die mikroskopische Analyse.

Nachdem Sie die Bakterien über Nacht gezüchtet haben, zentrifugieren Sie die Kultur drei Minuten lang bei 5.000 g und suspendieren Sie das Pellet dann in 25 Millilitern sterilem 0,1-molaren Kaliumphosphatpuffer. Nach Wiederholung der Zentrifugation verwenden Sie denselben Puffer, um die endgültige Bakterienkonzentration auf 10 bis neunte Zellen pro Milliliter einzustellen.

Füllen Sie eine 6-Well-Mikroplatte mit 5 Millilitern der Bakteriensuspension. Schneide die Zellophanmembran der Pilzkultur mit einer sterilen Rasierklinge in Quadrate, auf denen sich jeweils eine Kolonie befindet. Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette Zellophanquadrate, die Hyphen enthalten, aus dem festen Medium und überführen Sie sie in einzelne Vertiefungen der Bakteriensuspension.

Schütteln Sie die Mikroplatte vorsichtig, bis sich die Pilzkolonien vom Zellophan gelöst haben. Entfernen Sie dann die Zellophanblätter, so dass die Pilzkolonien in der Platte verbleiben. Inkubieren Sie die Mikroplatte unter leichtem Rühren bei 20 Grad Celsius für eine Zeit, abhängig von den verwendeten Stämmen und dem zu analysierenden Tisch.

Bei P. fluorescens BBc6/L. bicolor inkubieren Sie die Kulturen 30 Minuten lang, um Biofilme im Frühstadium zu erhalten, und bis zu 16 Stunden lang für reife Biofilme. Um planktonische Bakterien und elektrostatisch an die Hyphen anhaftende Bakterien zu entfernen, spülen Sie den Pilz ab, indem Sie ihn auf eine neue 6-Well-Mikroplatte übertragen, die mit starker Salzlösung gefüllt ist. Schütteln Sie den Teller vorsichtig 1 Minute lang.

Übertragen Sie den Pilz auf eine neue 6-Well-Mikroplatte mit 5 Millilitern sterilem 0,1-molaren Kaliumphosphatpuffer. Schütteln Sie die Platte vorsichtig zwei Minuten lang und geben Sie dann den Pilz in frischen Puffer.

Während Sie die Pilzkolonie in Puffer halten, schneiden Sie die Kolonie mit einem Skalpell etwa in zwei Hälften. Die Hälfte der zu färbenden Kolonie wird in eine Petrischale mit 1 Milliliter sterilem Wasser gegeben, das mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff versetzt ist, um das Pilznetzwerk sichtbar zu machen, wie z. B. Weizenkeim-Agglutinin, das an Alexa Fluor633 konjugiert ist. Inkubieren Sie die Probe dann im Dunkeln.

Spülen Sie die Probe nach dem Färben ab, indem Sie sie auf einen Petrischalendeckel mit 10 Millilitern sterilem 0,1-molaren Kaliumphosphatpuffer geben, und schütteln Sie sie 1 Minute lang vorsichtig. Tauchen Sie einen Objektträger halb in den Deckel der Petrischale und positionieren Sie den geschnittenen Abschnitt vorsichtig so, dass er über dem Objektträger schwebt. Heben Sie dann die Seite langsam von der Pufferlösung ab, damit sich die Probe sanft auf dem Objektträger absetzen kann.

Der heikelste Aspekt ist die Positionierung der Probe auf dem Objektträger. Um eine Störung des Biofilms zu vermeiden, müssen die Probe und der Objektträger während der Positionierung der Probe eingetaucht werden, und die Probe darf vor der Bildgebung nicht mehr bewegt werden.

Zum Schluss geben Sie 10 Mikroliter Antifading-Eindeckmedium in die Probe und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab.