Echtzeit-Analyse der residenten T-Zell-Migration in verschiedenen Tumorregionen mittels konfokaler Mikroskopie

Beginnen Sie mit einem Lungentumorschnitt, der residente T-Zellen enthält.

T-Zellen wandern durch die Mikroumgebung des Tumors und interagieren mit Tumorzellen und Stromaelementen, die Immunfunktionen erfüllen.

Die Zusammensetzung der Tumormikroumgebung hat einen starken Einfluss auf die Verschiebung und Geschwindigkeit der T-Zellen.

Fügen Sie unterschiedliche fluoreszenzgekoppelte Antikörper hinzu, um T-Zellen, Tumorzellen und stromale Elemente in der Mikroumgebung zu markieren.

Fügen Sie DAPI hinzu, das Zellen mit einer beschädigten Plasmamembran infiltriert, um den Zellkern zu färben und so die Visualisierung nekrotischer Regionen innerhalb des Tumors zu ermöglichen.

Beobachten Sie die gefärbte Probe unter einem konfokalen Mikroskop.

Wählen Sie mit einem geeigneten Fluoreszenzlicht eine Tumorregion von Interesse aus, die residente T-Zellen enthält. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit von Zellen durch die Bewertung von DAPI-positiven Zellen.

Definieren Sie für die Echtzeitanalyse Zeitintervalle und die Gesamtaufzeichnungszeit.

Um Z-Stapel-Bilder zu erfassen, beginnen Sie mit einer Tiefe unterhalb der beschrifteten T-Zellen und erfassen Sie Bilder in verschiedenen Zeitintervallen.

Verwenden Sie Tracking-Software, um die Länge der T-Zell-Verdrängung und die durchschnittliche Geschwindigkeit in verschiedenen Tumorregionen zu vergleichen.

Verdünnen Sie die erforderlichen fluoreszenzmarkierten Antikörper und den Fluoreszenz-Kernfarbstoff DAPI auf die erforderlichen Endkonzentrationen in phenolrotfreiem RPMI-Medium. Nehmen Sie dann die Kulturplatte aus dem Inkubator und saugen Sie die Flüssigkeit mit einer feinen Spitze in den Edelstahlscheiben ab.

Geben Sie nun, ohne die Scheibe zu berühren, 40 Mikroliter der verdünnten Antikörper auf jede Tumorscheibe. Um das Färben zu ermöglichen, inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem der Färbeschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie mit einer feinen Zange die Unterlegscheiben. Nehmen Sie dann die Scheiben vorsichtig heraus und tauchen Sie sie 10 Sekunden lang in phenolrotfreies RPMI1640 Medium. Legen Sie die Scheiben wieder auf die Zellkultureinsätze und geben Sie einen Tropfen phenolrotfreies RPMI1640 Medium über jede Scheibe. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fahren Sie dann mit der Bildgebung fort.

Stellen Sie einige Stunden vor Beginn dieses Experiments die Temperatur der Wärmekammer des Mikroskops auf 37 Grad Celsius ein und bereiten Sie dann das Mikroskop so vor, dass die Tumorschnitte ständig mit sauerstoffhaltigem phenolrotfreiem RPMI-Medium durchblutet werden und die Lösung mit einer Peristaltikpumpe in einen Abfallsammelkolben abgesaugt wird.

Heben Sie die fleckige Scheibe mit Hilfe einer feinen Pinzette aus der Sechs-Well-Platte und geben Sie sie in eine 35-Millimeter-Kunststoffschale, die mit phenolrotfreiem RPMI-Medium gefüllt ist, und platzieren Sie dann einen Scheibenanker über der Scheibe, um sie zu stützen. Stellen Sie als Nächstes diese Petrischale auf den Bildgebungstisch des Mikroskops.

Schalten Sie nach dem Anschließen der Einlass- und Auslassspitzen des Perfusionssystems die Peristaltikpumpe ein, damit das sauerstoffhaltige Medium durch die Perfusionsschläuche strömen kann. Senken Sie das Wasserimmersionsobjektiv auf die Scheibe ab und fokussieren Sie auf die Oberseite der Scheibe mit Hellfeldlicht oder mit der entsprechenden Wellenlänge.

Visualisieren und wählen Sie dann mit geeigneten Filtern eine Region of Interest aus, die alle fluoreszenzmarkierten Zellen von Interesse enthält, nämlich die CD8-T-Zellen, die Tumorinseln und die CD90-positiven Stromazellen. Richten Sie eine Bildgebungssitzung mit geeigneter Laserintensität und Belichtungszeiten ein, die der Helligkeit der beobachteten Fluoreszenzsignale entsprechen. Richten Sie dann die Dicke des Z-Stapels für das Bild innerhalb des Tumorschnitts ein.

Wählen Sie als Nächstes das Zeitintervall für das Z-Stapel-Bild und die Gesamtaufnahmezeit aus, um Bilder in bestimmten Zeitintervallen aufzunehmen. Analysieren Sie nach dem Aufnehmen und Exportieren der Fluoreszenzbilder die Migration der CD8-T-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.