Eine FRET-Durchflusszytometrie-Technik zum Nachweis der Tau-Seed-induzierten Aggregation von Reporterproteinen

Nehmen Sie eine Säugetierzellkultur, die die Wiederholungsdomäne des Mikrotubuli-bindenden Proteins Tau exprimiert.

Diese zytoplasmatischen Tau-Reporter besitzen eine aggregationsanfällige Mutation und liegen als Monomere vor.

Die Reporter sind entweder mit Fluorophor A oder B fusioniert, wobei sich das Emissionsspektrum des ersteren mit dem Absorptionsspektrum des letzteren überschneidet.

Fügen Sie ein Liposom hinzu, das mit Tau-Samen oder fibrillären Aggregaten aus Tau in voller Länge komplexiert ist.

Beim Eintritt in die Zelle setzt das Liposom die Seeds im Zytoplasma frei.

Die freigesetzten Samen vermitteln die Aggregation der Tau-Reporter, wodurch Fluorophor A in die Nähe von Fluorophor B gebracht wird.

Fügen Sie Trypsin hinzu, um die Zellen zu lösen, und führen Sie dann die Fixierung durch.

Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.

Aufgrund der Nähe innerhalb des Aggregats wird der Energietransfer von Fluorophor A nach B bei Anregung über eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung als Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer oder FRET bezeichnet.

Das angeregte Fluorophor B sendet ein FRET-Signal aus, dessen Vorhandensein auf eine Proteinaggregation hinweist.

Um die Biosensor