Eine FRET-Durchflusszytometrie-Technik zum Nachweis der Tau-Seed-induzierten Aggregation von Reporterproteinen

Nehmen Sie eine Säugetierzellkultur, die die Wiederholungsdomäne des Mikrotubuli-bindenden Proteins Tau exprimiert.

Diese zytoplasmatischen Tau-Reporter besitzen eine aggregationsanfällige Mutation und liegen als Monomere vor.

Die Reporter sind entweder mit Fluorophor A oder B fusioniert, wobei sich das Emissionsspektrum des ersteren mit dem Absorptionsspektrum des letzteren überschneidet.

Fügen Sie ein Liposom hinzu, das mit Tau-Samen oder fibrillären Aggregaten aus Tau in voller Länge komplexiert ist.

Beim Eintritt in die Zelle setzt das Liposom die Seeds im Zytoplasma frei.

Die freigesetzten Samen vermitteln die Aggregation der Tau-Reporter, wodurch Fluorophor A in die Nähe von Fluorophor B gebracht wird.

Fügen Sie Trypsin hinzu, um die Zellen zu lösen, und führen Sie dann die Fixierung durch.

Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.

Aufgrund der Nähe innerhalb des Aggregats wird der Energietransfer von Fluorophor A nach B bei Anregung über eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung als Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer oder FRET bezeichnet.

Das angeregte Fluorophor B sendet ein FRET-Signal aus, dessen Vorhandensein auf eine Proteinaggregation hinweist.

Um die Biosensorzellen unter sterilen Bedingungen neu zu beschichten, spülen Sie jede Zelllinie mit warmem PBS, gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation mit Trypsin-EDTA. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit warmem Kulturmedium und überführen Sie die Zellen sofort in ein konisches Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Medium. Zählen Sie dann die Zellen und führen Sie eine Mastermix-Zellverdünnung von 3.500.000 Zellen pro 13 Milliliter Medium durch. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette langsam 130 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung einer mit Flachbodengewebekulturen behandelten 96-Well-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Pipettenspitzen in der Mitte der Vertiefungen platziert werden, ohne den Boden der Platte zu berühren.

Sobald die Zellen plattiert wurden, lassen Sie sie 10 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur absetzen und inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und mindestens 80 % relativer Luftfeuchtigkeit. Am nächsten Tag, wenn die Biosensorzellen zu 60 % bis 65 % konfluent sind, kombinieren Sie reduziertes Serummedium, Liposomenreagenz und biologische Samenquelle, um Transduktionskomplexe zu bilden.

Pipettieren Sie dann vorsichtig 20 Mikroliter Transduktionskomplex an der Seite jeder einzelnen Biosensor-Vertiefung entlang und geben Sie die behandelten Zellen für weitere 24 bis 48 Stunden in den Inkubator zurück. Vor der Ernte zeigen unbehandelte Zellen nur diffuse Fluoreszenz. Zellen, die mit Tau-Samenmaterial behandelt wurden, zeigen jedoch nach 1 bis 2 Tagen helle Aggregate.

Um die Zellen zu ernten, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch 50 Mikroliter Trypsin-EDTA und stoppen Sie die Reaktion nach 5 Minuten mit 150 Mikrolitern gekühltem Kulturmedium. Übertragen Sie die Zellen sofort auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden und pelletieren Sie die Zellen. Aspirieren Sie den Überstand, ohne die Pellets zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen dann sanft, aber gründlich in 50 Mikrolitern 2%igem Paraformaldehyd für 10 Minuten. Schleudern Sie dann die Zellen wieder herunter und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern gekühltem Durchflusszytometrie-Puffer

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