Entstehung von Influenzavirus-Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper

Nehmen Sie eine Influenzavirussuspension, die sowohl Wildtyp- als auch mutierte Stämme enthält.

Ein virales Hüllglykoprotein, das als Hämagglutinin oder HA bezeichnet wird, bindet an Sialinsäure auf der Oberfläche der Wirtszelle und vermittelt den Eintritt des Virus.

Fügen Sie einen neutralisierenden Antikörper in abnehmenden Konzentrationen hinzu, der an HA bindet und die Sialinsäure-Bindungsstelle blockiert.

Mutierte Stämme, die Mutationen in der HA tragen, die helfen, eine Neutralisierung von Antikörpern zu vermeiden, werden als Escape-Varianten bezeichnet.

Injizieren Sie die Mischung in pathogenfreie embryonierte Hühnereier, geben Sie die Viren in die Allantoisflüssigkeit ab und inkubieren Sie.

Antikörper-neutralisierte Viren können nicht in die Zellen der Chorioallantoismembran eindringen. Nicht neutralisierte mutierte Viren dringen in die Zellen ein, replizieren sich und werden in die Allantoisflüssigkeit freigesetzt.

Ernten Sie die Allantoisflüssigkeit, die die Viruspopulation enthält.

Führen Sie einen HA-spezifischen Antikörper in abnehmenden Konzentrationen ein, der die anderen Stämme mit Ausnahme der Escape-Varianten neutralisiert.

Führen Sie rote Blutkörperchen oder Erythrozyten von Hühnern ein. Nicht neutralisierte Escape-Varianten binden an die Zellen und verursachen die Verklumpung von Erythrozyten – die sogenannte Hämagglutination, die die Bildung von Escape-Varianten bestätigt.

Neutralisierende Antikörper, die HI-Aktivität aufweisen, werden weiter analysiert, indem zunächst 4 Verdünnungen des interessierenden Antikörpers in steigenden Konzentrationen in 1-facher PBS-Dosis in einem Volumen von 100 Mikrolitern pro Verdünnung hergestellt werden. Bereiten Sie als Nächstes einen Virusbestand von 1 Million plaquebildenden Einheiten pro Milliliter in 1 mal PBS in einem Volumen von 400 Mikrolitern vor.

Mischen Sie dann 100 Mikroliter von 1 Million plaquebildenden Einheiten pro Milliliter Virus mit 100 Mikrolitern jeder Antikörperverdünnung oder 100 Mikrolitern von 1 mal PBS. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Nach kurzem Vortexen injizieren Sie 200 Mikroliter jeder Mischung in spezifische, pathogenfreie embryonierte Hühnereier. Dann brüten Sie die Eier 40 bis 44 Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid aus. Nach der Inkubation opfern Sie die mit dem Virus infizierten embryonierten Eier, indem Sie sie mindestens 6 Stunden lang bei 4 Grad Celsius aufbewahren. Ernten Sie als Nächstes die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern, wie zuvor beschrieben.

Bestätigen Sie abschließend die Escape-Varianten, indem Sie den HI-Assay durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben.