Ein zellbasierter Assay zur Beurteilung der Aufnahme des Tau-Proteins durch Mikroglia

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit flachem Boden, die anhaftende murine Mikroglia – phagozytische Zellen im Gehirn

Führen Sie ein serumfreies Medium ein, das Immunkomplexe enthält. Diese Komplexe bestehen aus Antikörpern, die an phosphorylierte Tau-Protein-Aggregate gebunden sind, die bei bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen gebildet werden.

Die Tau-Aggregate sind mit einem pH-empfindlichen grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert.

Während der Inkubation interagieren diese Immunkomplexe mit den Fc-Rezeptoren der Mikrogliazellen und erleichtern deren Verschlingung.

Dieses Immunkomplex-haltige Endosom verschmilzt mit einem Lysosom und bildet ein Endolysosom. Das saure Milieu des Endolysosoms lässt die Farbstoffmoleküle fluoreszieren.

Waschen, um die nicht internalisierten Immunkomplexe zu entfernen.

Mit Trypsin-EDTA-Lösung behandeln, um die Zellen abzulösen.

Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine U-Bodenplatte, die über Eis positioniert ist, um das Endolysosom zu stabilisieren. Pelletieren Sie die Zellen und entsorgen Sie den Überstand.

Waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie mit FACS-Puffer.

Identifizieren Sie mit FACS die einzelnen lebenden Zellen und quantifizieren Sie die Intensität der grünen Fluoreszenz, um die Tau-Aufnahme durch Mikroglia zu beurteilen.

Am ersten Tag des Experiments bereiten Sie die BV-2-Zellen vor, indem Sie sie zunächst mit 1x PBS in dem Kolben waschen, in dem sie kultiviert wurden. Dann werden sie mit 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ inkubiert, bis sie sich aus dem Kolben lösen. Resuspendieren Sie die Zellen im Kulturmedium, indem Sie 3 bis 5 Mal auf und ab pipettieren.

Zählen Sie die Zellen und bereiten Sie eine Zellsuspension mit einer Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter in einem Kulturmedium mit 200 Mikrogramm pro Milliliter Heparin vor. Geben Sie 250 Mikroliter dieser Zellsuspension pro Vertiefung in eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂ über Nacht.

Nachdem Sie zuvor hergestellte pH-Farbstoff-Tau-Aggregate auf Eis aufgetaut haben, verdünnen Sie sie in 65 Mikrolitern pro Bedingung serumfreiem Medium, um eine 500-nanomolare Lösung herzustellen. Verdünnen Sie Antikörper in 65 Mikrolitern serumfreiem Medium, um die doppelte gewünschte Konzentration zu erreichen. Mischen Sie pH-Farbstoff-Tau-Aggregate und Antikörper in einer 96-Well-U-Bodenplatte. Verschließen Sie diese Verdünnungsplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium von der 96-Well-Platte mit BV-2-Zellen. Waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 100 Mikrolitern Raumtemperatur 1x PBS. Entfernen Sie PBS von der BV-2-Zellplatte. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 125 Mikroliter Immunkomplexe von der Verdünnungsplatte in jede Vertiefung einer 96-Well-BV-2-Zellplatte zu übertragen, und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂.

Entfernen Sie nach der Inkubation die Immunkomplexe aus den Zellen und waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit 100 Mikrolitern Raumtemperatur 1x PBS. Nach Entfernen des 1x PBS 50 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA hinzufügen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO₂ inkubieren. Fügen Sie danach 200 Mikroliter Kulturmedium hinzu und resuspendieren Sie die Vertiefung, indem Sie auf und ab pipettieren, um die Zellen zu lösen.

Übertragen Sie die Zellen auf eine 96-Well-U-Bodenplatte und zentrifugieren Sie sie bei 400 mal g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Lege die Platte auf Eis und entferne das Medium. 150 Mikroliter eiskaltes 1x PBS dazugeben und erneut bei 400 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Legen Sie die Platte auf Eis und waschen Sie sie erneut, indem Sie zuvor 1x PBS entfernen und 150 Mikroliter eiskaltes PBS pro Vertiefung hinzufügen. Unter den gleichen Bedingungen erneut zentrifugieren.

Stellen Sie die Platte auf Eis und waschen Sie die Zellen, indem Sie das zuvor hinzugefügte PBS entfernen und 150 Mikroliter FACS-Puffer pro Vertiefung hinzufügen. Erneut bei 400 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Legen Sie die Platte auf Eis, entfernen Sie den zuvor hinzugefügten FACS-Puffer und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern FACS-Puffer pro Well. Fahren Sie sofort mit der Analyse durch FACS fort, um 20.000 Ereignisse im Live-Cell-Gate zu erfassen.