Ein Assay zur Messung des neutralisierenden Antikörpertiters, der spezifisch für das Respiratorische Synzytialvirus ist

Nehmen Sie seriell verdünntes, hitzeinaktiviertes Humanserum ein, das das Respiratorische Synzytial-Virus oder RSV-spezifische neutralisierende Antikörper enthält.

Fügen Sie die Virussuspension hinzu. Die Antikörper neutralisieren die Viren verdünnungsabhängig.

Die Mischung wird in humane Epithelzell-Monoschichten eingebracht und zur Virusadsorption inkubiert.

Entsorge die Mischung. Carboxymethylcellulose-haltige Medien werden zugegeben, so dass eine halbfeste Überlagerung entsteht. Ausbrüten.

RSV nutzt die Maschinerie der Wirtszelle, um virale RNA und Proteine zu synthetisieren, die sich anschließend zusammensetzen und als einzelne Virionen knospen.

Infizierte Zellen sterben schließlich ab. Carboxymethylcellulose schränkt die Virusbewegung ein, was zu einer lokalen Infektion und zum Zelltod führt und Plaques bildet.

Entfernen Sie das Overlay.

Fixieren Sie die Zellen mit einem acetonhaltigen Puffer. Führen Sie einen detergenzienhaltigen Blockierungspuffer ein, um die Zellen zu permeabilisieren und unspezifische Antikörperwechselwirkungen zu verhindern.

Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf virale Proteine abzielen.

Overlay mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die auf die Primärantikörper abzielen.

Bilden Sie die Vertiefungen ab, um fluoreszierende Plaques zu quantifizieren.

Die höchste Serumverdünnung, die fünfzig Prozent des RSV neutralisiert, stellt den Neutralisationstiter dar.

Untersuchen Sie vor der Inokulation von A549-Zellen mit RSV die Zellplatte unter einem Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass die A549-Zellmonoschichten zu 80 % konfluent sind. Drehen Sie dann die Platte vorsichtig um, um das Medium zu entsorgen, und tupfen Sie die Platte leicht auf einem sterilen, saugfähigen Papiertuch ab. Nach jeder Wäsche mit gefiltertem, sterilem PBS.

Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter des Virus-Serum-Gemisches pro Vertiefung in die entsprechenden Vertiefungen auf der A549-Zellplatte gemäß der im Manuskript bereitgestellten Plattenvorlage und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid für eine Stunde. Am Ende der Inkubation entnehmen Sie mit einer Pipette 90 Mikroliter pro Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter des Mediums hinzu, das 1X M 199, 1,5 % CMC und 2 % FCS und Penicillin-Streptomycin-Gemisch enthält. Inkubieren Sie die Platte drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Um eine Assay-Platte zu fixieren und zu entwickeln, invertieren Sie zunächst die RSV-infizierte A549-Zellplatte vorsichtig, um das Medium zu verwerfen, das M 199, CMC, 2 % FCS und ein Penicillin-Streptomycin-Gemisch enthält. Geben Sie dann langsam 200 Mikroliter des Fixierungspuffers in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten. Entsorgen Sie dann den Fixierungspuffer und tupfen Sie ihn vorsichtig auf ein saugfähiges Papiertuch.

Lassen Sie den Teller mit der Vorderseite nach unten 10 Minuten trocknen. Stellen Sie dann mit gefiltertem PBS-Puffer, der 0,05 Polysorbat-20 enthält, eine 5%ige Milchblockierungslösung her. Geben Sie 200 Mikroliter der Blockierungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Platte am Ende der Inkubation vorsichtig um, um die Lösung zu verwerfen, und tupfen Sie sie auf ein saugfähiges Papiertuch.

Um den primären Antikörper herzustellen, verdünnen Sie 1 bis 500 Goat X RSV-Antikörper in der Blockierungslösung. Geben Sie 50 Mikroliter in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Platte dreimal mit gefiltertem PBS-Polysorbat.

Stellen Sie als Nächstes den Sekundärantikörper her, indem Sie 1 bis 5.000 AlexaFluor Donkey Anti-Goat Immunglobulin G in der Blockierungslösung verdünnen. Geben Sie 50 Mikroliter in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Platte fünfmal mit gefiltertem PBS-Polysorbat.

Um Plaques mit einem automatischen Spot-Reader zu zählen, verwenden Sie zunächst eine unbenutzte 96-Well-Kulturplatte, um das Gerät zu kalibrieren, indem Sie die Zähleinstellungen im FITC-Kanal eingeben. Lesen Sie dann die Zellplatte ab, wickeln Sie sie in Folie ein und lagern Sie sie bei 4 Grad Celsius. Überprüfen Sie als Nächstes die Bilder der Vertiefungen auf künstliche Plaques oder zerbrochene Zellmonoschichten und schließen Sie Vertiefungen mit gestörten Zellmonoschichten aus.