Nachweis von humanen Insel-Autoantikörpern mittels eines Elektrochemilumineszenz-Assays

Um Insel-Autoantikörper – einen Biomarker für Typ-1-Diabetes – nachzuweisen, nehmen Sie menschliche Serumproben und fügen Sie Essigsäure hinzu, um störende Komponenten zu hemmen.

Inkubieren und dann einen alkalischen Puffer hinzufügen, um die Säure zu neutralisieren.

Das behandelte Serum wird auf eine Multiwell-Platte übertragen, die eine Mischung aus Autoantigenen für menschliche Inseln, einschließlich biotinylierter Fänger- und Ruthenium-konjugierter Antigene, jeweils in einer optimalen Konzentration für den Assay enthält.

Der Inselautoantikörper in der positiven Probe verbindet das Ruthenium-konjugierte Antigen mit dem biotinylierten Capture-Antigen und bildet einen Antigen-Antikörper-Komplex.

Übertragen Sie das Gemisch in eine mit Streptavidin beschichtete Elektrochemilumineszenzplatte, die mit einem Blockierungsmittel vorbehandelt und mit Arbeits- und Gegenelektroden ausgestattet ist.

Inkubieren, um biotinylierte komplexe Wechselwirkungen mit dem gebundenen Streptavidin zu ermöglichen, und dann waschen.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der Tripropylamin oder TPA enthält.

In einem Elektrochemilumineszenz-Instrument wird durch die angelegte Spannung zwischen den Elektroden die Oxidation von Ruthenium und TPA eingeleitet, wodurch TPA-Radikale entstehen.

Die TPA-Radikale regen Rutheniumkomplexe an, die Photonen emittieren, während sie in ihren Grundzustand zurückkehren.

Eine hohe Chemilumineszenz in der positiven Probe weist auf das Vorhandensein von Inselautoantikörpern hin.

Mischen Sie das humane Insel-Autoantigen mit Biotin oder Sulfo-Tag im molaren Verhältnis 1:5 in einem Röhrchen und decken Sie das Röhrchen mit Alufolie ab, da beide Tags lichtempfindlich sind. Inkubieren Sie das Röhrchen dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit, während der Inkubation, grundieren Sie die Spin-Säule mit zweifach phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Zentrifugieren Sie dann die Säule jeweils zwei Minuten lang bei 1.000 mal g. Als nächstes zentrifugieren Sie das Autoantigen-Tag-Gemisch in der Spin-Säule bei 1.000 mal g für 2 Minuten. Dann aliquotieren und lagern Sie das markierte Antigen bei minus 80 Grad Celsius.

Als nächstes verwenden Sie die rationale Konzentration des Biotin-Sulfo-Tag-markierten Antigens basierend auf dem Schachbrett-Assay für den Antigenpuffer, um 3 Milliliter Antigenlösung pro 96-Well-Platte herzustellen.

Fügen Sie dann in jede Vertiefung 4 Mikroliter Serum hinzu und stellen Sie das endgültige Volumen mit 1-fach phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 20 Mikroliter ein. Geben Sie dann 20 Mikroliter markierte Antigenlösung in jede Vertiefung und decken Sie die Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu verhindern. Dann die Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker geben.

Sobald der Shaker stoppt, lassen Sie die Platte bei 4 Grad Celsius 18 bis 24 Stunden im Kühlschrank. Mischen Sie nun für jede Probe 15 Mikroliter Serum mit 18 Mikrolitern 0,5 molare Essigsäure und inkubieren Sie diese 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Auf der Grundlage des Schachbrett-Assays wird die rationale Konzentration des mit Biotin-Sulfo-Tags markierten Antigens verwendet, um die Antigenlösung herzustellen.

Aliquotieren Sie dann 35 Mikroliter des Antigenpuffers in jeder Vertiefung einer neuen PCR-Platte. Kurz bevor die Inkubation der Serummischung abgeschlossen ist, fügen Sie 3,8 Mikroliter 1 molaren Tris-Puffer bei einem pH-Wert von neun entlang der Seite jeder Vertiefung auf der Antigenplatte hinzu.

Sobald die Inkubation beendet ist, geben Sie schnell 25 Mikroliter des mit Essigsäure behandelten Serums in jede Vertiefung der Antigenplatte und rühren Sie die Lösung. Decken Sie dann die PCR-Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu vermeiden, und legen Sie sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Platte bei 4 Grad Celsius in den Kühlschrank und inkubieren Sie sie 18 bis 24 Stunden lang.

Nehmen Sie die Streptavidin-Platte bei 4 Grad Celsius aus dem Kühlschrank und lassen Sie die Platte Raumtemperatur erreichen. Nachdem die Streptavidin-Platte Raumtemperatur erreicht hat, geben Sie 150 Mikroliter 3% Blocker A in jede Vertiefung, decken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie ab und inkubieren Sie sie über Nacht im Kühlschrank.

Nehmen Sie am nächsten Tag die Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie den Puffer aus den Vertiefungen. Trocknen Sie dann die Platte, indem Sie sie kopfüber auf einige trockene Papiertücher legen, damit der restliche Puffer einweichen kann. Fügen Sie dann 150 Mikroliter 1-fachen PBST-Puffer hinzu, um die Mulde drei Mal hintereinander zu waschen.

Übertragen Sie anschließend 30 Mikroliter Serumantigen-Inkubat in jede Vertiefung der Streptavidin-Platte und decken Sie die Platte mit Folie ab, um Licht zu vermeiden. Dann die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker geben. Nach einer Stunde verwerfen Sie das Serumantigen-Inkubat von der Platte und fügen Sie 150 Mikroliter 1-fachen PBST-Puffer hinzu, um die Vertiefung dreimal zu waschen. Sobald der Waschvorgang beendet ist, geben Sie 150 Mikroliter Lesepuffer in jede Vertiefung, um sie auf einem Plattenleser abzulesen.