Name: Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Lernen Sie biophysikalische Assays zur Messung mechanischer Eigenschaften des Zellkerns und der Wechselwirkung mit dem Zytoskelett in lebenden Zellen. Diese Methoden ermöglichen präzise Analysen der Kernsteifigkeit.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01 HL082792 und R01 NS059348) und dem Brigham and Women Hospital Cardiovascular Leadership Group-Award unterstützt.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Substrat-Stamm-Test Dehnungs-Anwendung wurde erfolgreich von uns und anderen Gruppen verwendet werden, um induzierte atomare Verformungen in den Zellen unterzogen, um mechanische Belastungen zu untersuchen und den Beitrag der spezifischen Kernhüllenproteine ​​der nuklearen Steifigkeit zu untersuchen. 4-8 Der Vorteil dieser Technik ist, dass es Sonden mechanischen Eigenschaften Lebensstandard Kerne in ihrer normalen zellulären und Zytoskelett-Umgebung und das Substrat Belastung Anwend...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker Red FM und Green FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 und M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Hanks Buffered Saline Salz </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Phenol frei, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Borosilikatglas mit Filament </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78 bis 10 </td></tr><tr><td> Gloss / Gloss unverstärkten Silikon-Folien, 0,005 &quot; </td><td> Sonstige Manufacturing Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphate Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 mm Glasboden Kulturschalen (FluoroDish) </td><td> World Precision Instruments, Inc </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 Vakuumfett </td><td> Spi liefert </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

biophysikalische assays auf die mechanischen eigenschaften der interphase zellkern probe: substrat dehnungs-anwendung und mikronadel manipulation

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In den meisten eukaryotischen Zellen ist der Kern der größten Organelle und ist in der Regel 2 bis 10 mal steifer als die umgebenden Zytoskeletts, folglich tragen die physikalischen Eigenschaften des Kerns wesentlich zur umfassenden biomechanischen Verhalten von Zellen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Zum Beispiel bei der Migration von Neutrophilen und eindringende Krebszellen, nukleare Steifigkeit kann ein großes Hindernis bei der Extravasation oder Durchfahrt durch Engstellen im Gewebe darstellen. 1 Auf der anderen Seite erfordert der Kern der Zellen in mechanisch aktive Gewebe wie Muskeln ausreichende strukturelle Unterstützung standhalten repetitive mechanische Beanspruchung. Wichtig ist, dass der Kern fest in der zellulären Architektur integriert, es ist physikalisch mit dem umgebenden Zytoskelett, das eine entscheidende Voraussetzung für die intrazelluläre Bewegung und Positionierung des Kerns, zum Beispiel in polarisierten Zellen, synaptische Kerne an neuromuskulären Synapsen verbunden ist, oder bei der Migration von Zellen. 2 Nicht überraschend, dass Mutationen in Kernhüllenproteine ​​wie Lamine und nesprins, die eine entscheidende Rolle spielen bei der Bestimmung nuklearen Steifigkeit und nucleo-Zytoskelett-Kopplung, wurden kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krankheiten, darunter ausgewiesen Emery- Dreifuss Muskeldystrophie, Körper-Muskeldystrophie und Kardiomyopathie. 3 Um die biophysikalischen Funktion der verschiedenen Kernhüllenproteine ​​und die Wirkung der spezifischen Mutationen zu untersuchen, haben wir experimentelle Methoden, um die physikalischen Eigenschaften des Kerns in einzelnen lebenden Zellen Studie entwickelt unterzogen, um globale oder lokale mechanische Störung. Mess-induzierte atomare Verformungen in Reaktion auf genau angewendet Substrat Belastung Anwendung liefert wichtige Informationen über die Verformbarkeit des Kerns und ermöglicht quantitative Vergleich zwischen verschiedenen Mutationen oder Zelllinien Mangel für bestimmte Kernhüllenproteine. Lokalisierte Zytoskelett-Dehnungs-Anwendung mit einer Mikronadel wird verwendet, um diesen Test zu ergänzen und zusätzliche Informationen über die intrazelluläre Kraftübertragung zwischen dem Kern und dem Zytoskelett Ertrag. Studieren nuklearen Mechanik in intakten lebenden Zellen erhält die normale intrazelluläre Architektur und vermeidet mögliche Artefakte, die entstehen, wenn die Arbeit mit isolierten Kernen kann. Darüber hinaus präsentiert Substrat Belastung Anwendung ein gutes Modell für die physiologischen Stress, der durch Zellen in Muskel oder anderen Geweben (zB vaskuläre glatte Muskelzellen Schiff Belastungen ausgesetzt) ​​erlebt. Schließlich, während diese Werkzeuge wurden in erster Linie die nukleare Mechanik Studie entwickelt, können sie auch angewendet, um die Funktion des Zytoskelett-Proteine ​​und Mechanotransduktion Signalisierung zu untersuchen.

Wir stellen zwei unabhängige, Mikroskop-basierten Tools zur induzierten Nuklear-und Zytoskelett-Verformungen in Einzel-, Wohn adhärente Zellen in Reaktion auf die globale oder lokale Dehnung Anwendung zu messen. Diese Techniken werden verwendet, um nukleare Steifigkeit (dh, Verformbarkeit) zu ermitteln und intrazellulären Kraftübertragung zwischen dem Kern und dem Zytoskelett-Sonde.

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

In den meisten eukaryotischen Zellen ist der Zellkern das größte Organell und typischerweise 2- bis 10-mal steifer als das umgebende Zytoskelett; folglich ist das ...

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, die mechanischen Eigenschaften der Schnittstelle zwischen Zellkern und dessen physikalischer Verbindung mit dem umgebenden Cytoskelett zu messen. Dies wird erreicht, indem mechanische Dehnung auf Zellen ausgeübt wird, die auf einer transparenten Silikonmembran kultiviert sind, und die induzierten Verformungen des Zellkerns abgebildet werden. Größere Kerndeformationen entsprechen einer verringerten Steifigkeit des Kerns, da auch Veränderungen in der Kopplung zwischen Nukleus und Cytoskelett die induzierten Kerndeformationen beeinflussen können.Die intrazelluläre Kraftübertragung zwischen Cytoskelett und Zellkern wird direkt untersucht, indem lokalisierte Dehnung auf das Cytoskelett ausgeübt wird. Anschließend werden die Verschiebungen fluoreszenzmarkierter nukleärer NU- und cytoskelettaler Strukturen abgebildet. Die Ergebnisse zeigen die Steifigkeit der Zellkerne im Verhältnis zum umgebenden Cytoskelett.Aufgrund der Substrat-Dehnungsversuche zeigt der Mikronadel-Manipulationsassay, dass die Störung der Kopplung zwischen Nukleus und Zytoskelett zu Defekten bei der intrazellulären Kraftübertragung führt. Der Hauptvorteil

biophysical-assays-to-probe-mechanical-properties-interphase-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Beschrieben werden Protokolle zur Quantifizierung mechanischer Wechselwirkungen zwischen adhärenten Zellen und mikrostrukturierten Substraten. Diese Wechselwirkungen sind eng mit essentiellen Zellverhaltensweisen wie Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose verknüpft. Die Protokolle stellen eine Open-Source-Bildanalysesoftware namens MechProfiler vor, die es ermöglicht, die beteiligten Kräfte für jeden Mikropfosten zu bestimmen.

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.

Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Wir stellen eine Methode der Zellinjektion mittels nadelfreier Wasserstrahltechnologie vor, die mit einer Folge von Untersuchungen nach der Entbindung in Bezug auf Zelllebensfähigkeit, Proliferation und Elastizitätsmessungen verbunden ist.

Injektion von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stromazellen mittels Wasserstrahltechnologie

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Die Erforschung des zellulären Verhaltens unter mechanischer Belastung ist entscheidend für Fortschritte in der Zellmechanik und Mechanobiologie. Wir stellen die Fluoreszenz-Mikropipetten-Aspirationstechnik (fMPA) vor, eine neuartige Methode, die kontrollierte mechanische Stimulation mit einer umfassenden Analyse der intrazellulären Signalübertragung in einzelnen Zellen kombiniert. Diese Technik untersucht neue eingehende Studien der Mechanobiologie lebender Zellen.

Fluoreszenz-Mikropipetten-Aspirationsassay zur Untersuchung der Mechanosensorik roter Blutkörperchen

Lernen Sie biophysikalische Assays zur Messung mechanischer Eigenschaften des Zellkerns und der Wechselwirkung mit dem Zytoskelett in lebenden Zellen. Diese Methoden ermöglichen präzise Analysen der Kernsteifigkeit.

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation (Video) | JoVE Journal

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

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