Bewertung der intrazellulären Verteilung von Virus-abgeleiteten peptidmodifizierten Antikörperkonjugaten

Beginnen Sie mit anhaftenden menschlichen Erythroblastenzellen.

Einführung von Virus-abgeleiteten, peptidmodifizierten Antikörper-Konjugaten. Diese Konjugate enthalten eine nukleare Lokalisationssequenz (NLS) aus dem Virus und einen Cholsäurerest.

Während der Inkubation interagieren die Antikörperkonjugate mit Zelloberflächenrezeptoren und internalisieren in Endosomen.

Die Cholsäure im Konjugat hilft, aus dem endosomalen Kompartiment zu entkommen und ermöglicht so eine intrazelluläre Akkumulation, während die Transportproteine und NLS ihre Kernlokalisierung erleichtern.

Führen Sie Trypsin und EDTA-haltigen Puffer ein, um die Zellen abzulösen und oberflächengebundene Konjugate zu entfernen.

Fügen Sie mit Serum angereicherte Medien hinzu, um die Trypsinaktivität zu hemmen.

Zentrifuge, um die Zellen zu sammeln, sie zu fixieren und zu permeabilisieren.

Führen Sie dunkelrote, fluorophormarkierte Sekundärantikörper ein, die an lokalisierte Konjugate binden und waschen.

Mit einem nuklearen Färbefarbstoff behandeln.

Beobachten Sie unter einem konfokalen Mikroskop und nehmen Sie Bilder in verschiedenen planaren Tiefen auf.

Nach der Bildverarbeitung zeigt die Zelle kleine grün fluoreszierende Herde im Zytoplasma und im Zellkern, die die intrazelluläre Verteilung von Antikörperkonjugaten bestätigen.

Behandeln Sie Ziel-TF-1a-Zellen mit 200 nanomolaren 7G3-Cholsäure-Antikörper-Konjugaten. Zellen, die mit modifizierten monoklonalen Kontrollantikörpern behandelt wurden, sind einzuschließen. Inkubieren Sie 5 x 10⁶ antigen-positive Zellen mit den Konjugaten bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter eiskaltem PBS dreimal.

Fügen Sie frisches Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen eine weitere Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter PBS mit 0,25 % Trypsin und EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen bis zu 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann 1,5 Milliliter RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS, um das Trypsin zu neutralisieren.

Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern eiskaltem PBS noch einmal dreimal. Geben Sie 0,5 Milliliter 1% PFA und 1% Saccharose in PBS in die Zellen und legen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, um sie zu fixieren.

Waschen Sie die Zellen dann mit 0,5 Millilitern eiskaltem PBS dreimal und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 250-mal g. Geben Sie anschließend 0,15 % Triton X-100 in PBS zu den Zellen und permeabilisieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis. Waschen Sie dann mit eiskaltem PBS die Zellen und wiederholen Sie die Zentrifugation.

Suspendieren Sie die Zellen in 0,1 Millilitern PBS, die zwei Mikrogramm pro Milliliter eines anti-murinen sekundären polyklonalen Antikörpers enthalten, der an AlexaFluor 647 konjugiert ist, und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 250-mal g und verwenden Sie 0,5 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen dreimal zu waschen.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern PBS. Geben Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid in die Zellen. Verwenden Sie dann ein Eindeckmedium, um 1 x 10⁵ Zellen auf Objektträger zu montieren, bevor Sie die Probe mit einem Glasdeckglas abdecken. Untersuchen Sie die Zellen mit einem Plan Apo 60X Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur 1,42 an einem konfokalen inversen Laser-Scanning-Mikroskop.

Detektieren Sie PI-Fluoreszenz mit dem 488-Nanometer-Argonlaser und dem spektralen Scanning-Prisma-Set für 600 bis 650 Nanometer. Für die Fluoreszenz von AF 647 verwenden Sie den 633-Nanometer-Helium-Neon-Laser und das spektrale Scanning-Prisma-Set für 650 bis 700 Nanometer. Erfassen Sie Bilder von P1 und AF 647 nacheinander mit 1024 x 1024 Pixeln mit einer 2-fachen Mittelwertbildung, die in Abständen von 0,5 Mikrometern über die gesamte Zelldicke gemessen wird. Präsentieren Sie Bilder als Z-Projektionen.

Um die Zellen zu analysieren, bewerten und aufzeichnen, ob die intrazelluläre Fluoreszenz im Zytoplasma gruppiert und nahe der Zelloberfläche oder diffus und homogen ist. Bewerten Sie auch die relative Fluoreszenzintensität pro Zelle.