Detektion und Messung von Zielpeptiden mit einem kapazitiven Immunsonden-Biosensor

Beginnen Sie mit einem zusammengesetzten perfluoralkoxybeschichteten Platindraht mit einer Polydopaminschicht.

Weichen Sie diese Sonde in einer Lösung ein, die peptidspezifische Zielantikörper enthält, die an Polydopamin immobilisieren und eine Immunsonde bilden.

Waschen Sie die Immunsonde und platzieren Sie sie in einer Durchflusskammer mit einer Silberchlorid-Erdelektrode, um einen Stromkreis herzustellen.

Führen Sie zunächst den Puffer ein und legen Sie eine Spannung an, um die Immunsonde zu aktivieren, so dass sie als Batterie oder Kondensator fungieren und Energie als elektrische Ladung speichern kann.

Zeichnen Sie das elektrische Signal auf, um die Basislinie zu generieren.

Setzen Sie nun den Biosensor einer Lösung aus, die die Zielpeptide enthält.

Diese Peptide binden an die Antikörper auf der Sonde, was zu einer Veränderung der lokalen Ladung und der im Biosensor gespeicherten Energie führt.

Zeichnen Sie das elektrische Signal auf. Ein Anstieg des Signals weist auf das Vorhandensein des Zielpeptids hin, während die Größe dieses Signals mit der Zielpeptidkonzentration korreliert.

Schneiden Sie zunächst ein 25 Zentimeter langes Stück perfluoralkoxybeschichteten Platindraht ab. Entfernen Sie dann mit einem Skalpell etwa 5 Millimeter der Perfluoralkoxybeschichtung von einem Ende und achten Sie darauf, dass Sie nicht in den Platindraht schneiden. Führen Sie nun das abisolierte Ende des Platindrahtes in einen vergoldeten 1-Millimeter-Steckerstift ein. Crimpen Sie dann mit einer Spitzzange die Zähne des Steckerstifts um das abisolierte Ende des Platindrahts und löten Sie den Platindraht an den vergoldeten Anschlussstift.

Bereiten Sie anschließend die Dopaminlösung vor, indem Sie 50 Milligramm Dopaminhydrochlorid in 50 Milliliter 10 Millimolare PBS mit einem pH-Wert von 6 hinzufügen und unter Rühren mischen. Nachdem Sie das Dopamin vollständig aufgelöst haben, legen Sie die Spitze des Platindrahts in das Gefäß, in dem sich das frisch hergestellte mit Dopamin ergänzte PBS befindet. Verbinden Sie die Silberchlorid-Scheibenelektrode mit dem Massekanal in der Kopfstufe. Legen Sie dann die Silberchlorid-Scheibe in das Gefäß mit Dopamin-supplementiertem PBS und Platindraht.

Bevor Sie fortfahren, schließen Sie einen Draht-Shunt an die Referenzkanäle des Kopftisches an. Öffnen Sie die interaktive Datenerfassungssoftware und stellen Sie ein Sägezahn-Elektrodepositionsbefehlspotentialprotokoll ein, indem Sie das Startpotential auf minus 0,6 Volt, das Endpotential auf 0,65 Volt, die Abtastrate auf 0,04 Volt pro Sekunde und die Dauer der Abscheidung auf 420 Sekunden einstellen.

Nach Abschluss der Polydopaminabscheidung das Silberchlorid-gemahlene Pellet und die Spitze des Platindrahts aus dem Gefäß entfernen. Legen Sie die Drahtspitze für 2 bis 5 Minuten in ein Mikroröhrchen, das PBS mit einem pH-Wert von 7,4 enthält, und stellen Sie sicher, dass die Drahtspitze nicht mit den Seiten oder dem Boden des Mikroröhrchens in Berührung kommt. Bereiten Sie dann die Antikörperlösung vor, indem Sie den interessierenden Antikörper mit dem PBS von pH 7,4 in einem Verhältnis von 1 zu 20 in einem Gefäß geeigneter Größe kombinieren.

Als nächstes weichen Sie die mit Polydopamin abgeschiedene Spitze der Platinelektrode zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in Antikörperlösung ein, wobei Sie sicherstellen, dass die Platindrahtspitze in Lösung suspendiert ist und nicht auf der Innenfläche des Mikroröhrchens aufliegt. Platzieren Sie die Funktionsspitze der kapazitiven Immunsonde in der Durchflusskammer und achten Sie darauf, die Spitze der Elektrode in keiner Weise zu stören, da dies die sensorische Spitze der Sonde beschädigen könnte.

Führen Sie vor dem ersten experimentellen Test einen TBS-Standardlauf durch, um die kapazitive Immunsonde zu konditionieren, und stellen Sie für das Spannungsprotokoll das positive Schrittpotential auf 110 Millivolt, das negative Schrittpotenzial auf minus 5 Millivolt, die Schrittdauer von 20 Millisekunden und die Dauer der Erfassung auf 600 Sekunden ein.

Erstellen Sie als Nächstes die interessierende Peptidlösung mit demselben TBS. Um die Zusammensetzung des Superfusats beizubehalten, richten Sie ein Verteilersystem ein, in dem das Superfusat zwischen TBS und peptidergänztem TBS umgeschaltet werden kann. Verwenden Sie TBS-Standardparameter und richten Sie das Peptid-Sensing-Datenerfassungsprotokoll ein, indem Sie die Erfassungsdauer auf 360 Sekunden einstellen.