Bewertung des T-Zell-Rezeptor-induzierten Kalziumeinstroms mit einem Kalziumindikatorfarbstoff

Beginnen Sie mit einer Maus-T-Zell-Suspension und führen Sie einen Kalziumindikatorfarbstoff ein – Indo-1-Acetoxymethylester.

Der Farbstoff gelangt in die Zellen, wo intrazelluläre Esterasen die Acetoxymethylgruppe spalten, um membranundurchlässiges Indo-1 zu bilden, das in kalziumfreier und kalziumgebundener Form eine ausgeprägte Fluoreszenz aufweist.

Fügen Sie Fc-Rezeptor-Antikörper hinzu, um unspezifische Interaktionsstellen zu blockieren.

Einführung von Fluorophor-markierten Antikörpern zur Färbung von T-Zell-Untergruppen.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper und färben Sie sie mit einem Viabilitätsfarbstoff, der lebende und tote Zellen unterschiedlich färbt.

In der Durchflusszytometrie wird zunächst die schwache Fluoreszenz lebender Zellen nachgewiesen und fluorophormarkierte T-Zellen identifiziert, gefolgt von der Messung der Indo-1-Fluoreszenz in diesen Zellen.

Behandlung mit Anti-CD3-Antikörpern, die mit dem T-Zell-Rezeptor-CD3-Komplex interagieren und T-Zell-Signalwege aktivieren, wodurch der Kalziumeinstrom in das Zytosol induziert wird.

Der Farbstoff Indo-1 interagiert mit den freigesetzten Kalziumionen und verschiebt die Fluoreszenz des Farbstoffs von blau nach violett.