Bewertung des T-Zell-Rezeptor-induzierten Kalziumeinstroms mit einem Kalziumindikatorfarbstoff

Beginnen Sie mit einer Maus-T-Zell-Suspension und führen Sie einen Kalziumindikatorfarbstoff ein – Indo-1-Acetoxymethylester.

Der Farbstoff gelangt in die Zellen, wo intrazelluläre Esterasen die Acetoxymethylgruppe spalten, um membranundurchlässiges Indo-1 zu bilden, das in kalziumfreier und kalziumgebundener Form eine ausgeprägte Fluoreszenz aufweist.

Fügen Sie Fc-Rezeptor-Antikörper hinzu, um unspezifische Interaktionsstellen zu blockieren.

Einführung von Fluorophor-markierten Antikörpern zur Färbung von T-Zell-Untergruppen.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper und färben Sie sie mit einem Viabilitätsfarbstoff, der lebende und tote Zellen unterschiedlich färbt.

In der Durchflusszytometrie wird zunächst die schwache Fluoreszenz lebender Zellen nachgewiesen und fluorophormarkierte T-Zellen identifiziert, gefolgt von der Messung der Indo-1-Fluoreszenz in diesen Zellen.

Behandlung mit Anti-CD3-Antikörpern, die mit dem T-Zell-Rezeptor-CD3-Komplex interagieren und T-Zell-Signalwege aktivieren, wodurch der Kalziumeinstrom in das Zytosol induziert wird.

Der Farbstoff Indo-1 interagiert mit den freigesetzten Kalziumionen und verschiebt die Fluoreszenz des Farbstoffs von blau nach violett.

Die Verschiebung der Indo-1-Fluoreszenz von kalziumfreien zu kalziumgebundenen Zuständen bestätigt den T-Zell-Rezeptor-induzierten Kalziumeinstrom.

Bereiten Sie zunächst eine Stammlösung von 1 Mikrogramm pro Mikroliter Indo-1 AM vor, indem Sie 50 Mikroliter DMSO in ein Fläschchen geben, das 50 Mikrogramm Indo-1 AM enthält. Die Stammlösung wird in einem geeigneten Volumen cRPMI in einer Konzentration von 6 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt.

Legen Sie das Medium in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann dieses Medium, um eine zuvor hergestellte Zellsuspension im Verhältnis 1:1 zu verdünnen, um 5 bis 6 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie anschließend 1 Milliliter Zellsuspension pro Vertiefung und Versuchsbedingung in eine 12-Well-Gewebekulturplatte.

Bereiten Sie eine einfach gefärbte Kontrollprobe für kalziumfreies Indo-1 AM vor, indem Sie EGTA zu Indo-1-Farbstoffzellen hinzufügen. Reparieren Sie eine Vertiefung für die biologische Negativkontrolle ohne Fluorophore oder Indo-1-Farbstoff. Bereiten Sie eine Indo-1-Positivkontrolle vor, indem Sie Ionomycin in einer Konzentration von 50 Mikromol zu der farbstoffbeladenen Zellsuspension am Durchflusszytometer hinzufügen.

Bereiten Sie außerdem eine Vertiefung für die Einzelfärbekontrolle für zusätzliche Zellpopulationen unter Verwendung von Antikörper-konjugierten Fluorophoren vor. Fügen Sie dann 2 Mikrogramm FC-Rezeptor-blockierenden Antikörper pro Million Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang, wobei Sie alle 15 Minuten klopfen, um die Zellen wieder zu suspendieren.

Nach der Inkubation mischen und entfernen Sie das gesamte Zellvolumen von der Platte und geben Sie es in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Den Überstand zentrifugieren und dekantieren. Sobald die Zellen mit 1 Milliliter vorgewärmtem cRPMI gewaschen sind, pelletieren Sie erneut und dekantieren Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in 1 Milliliter cRPMI und inkubieren Sie jedes Röhrchen, wobei Sie die Oberseite des Röhrchens für den Gasaustausch leicht geöffnet lassen, was eine vollständige Entesterung der intrazellulären AM-Ester ermöglicht. Bereiten Sie als Nächstes einen Mastermix aller benutzerdefinierten Fluorochrom-konjugierten Antikörper vor und fügen Sie ihn für 1 Milliliter des Zellvolumens zu den ruhenden Zellen hinzu.

Nach der Ruhe die Zellen pelletieren und das Pellet waschen, indem Sie es in 1 Milliliter cRPMI resuspendieren, das auf 4 Grad Celsius gekühlt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Röhren auf Eis. Resuspendieren Sie einzelne Proben in 500 Mikrolitern phenolrotfreiem cRPMI unter Verwendung eines 5-Milliliter-Polystyrol-Durchflussröhrchens mit Kappe.

Um die Temperatur mit Hilfe der Kalziumflussanalyse aufrechtzuerhalten, bereiten Sie ein Perlbad vor, indem Sie Badeperlen in ein kleines Wasserbad geben und es auf bis zu 37 Grad Celsius erwärmen. Schneide ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen vorsichtig in zwei Hälften und entsorge den oberen Teil des Röhrchens. Füllen Sie die restliche Tube zu 3/4 mit Badeperlen und lassen Sie sie im Perlenbad 37 Grad Celsius erreichen.

Platzieren Sie das Bead-Bad in der Nähe eines Durchflusszytometers zusammen mit einem Styroporgestell, um das Röhrchen zu positionieren. Vor der Analyse am Durchflusszytometer erwärmen Sie die Röhrchen einzeln für sieben Minuten auf 37 Grad Celsius. Melden Sie sich bei der Durchflusszytometer-Software an und klicken Sie auf die Registerkarte Bibliothek.

Wählen Sie dann fluoreszierende Tags aus, um kalziumgebundenes Indo-1 und kalziumfreies Indo-1 hinzuzufügen. Wählen Sie dann unter Fluoreszierende Tag-Gruppen die Option UV-Laser aus und klicken Sie auf Plus Hinzufügen, um einen Fluoreszenz-Tag-Namen hinzuzufügen. Wählen Sie die Wellenlänge der Laseranregung und -emission aus und klicken Sie dann auf Speichern.

Fahren Sie mit dem Versuchsaufbau fort. Klicken Sie auf die Registerkarte Erfassung. Öffnen oder erstellen Sie ein neues Experiment und fügen Sie dem Experiment die gewünschten Fluoreszenz-Tags hinzu. Erstellen Sie eine Referenzgruppe und eine neue Beispielgruppe für das Experiment, und beschriften Sie beide Gruppen.

Legen Sie auf der Registerkarte Erfassungen fest, dass die Ereignisse auf das Maximum von 10 Millionen, das Stoppvolumen auf das maximale Volumen von 3.000 Mikrolitern und die Stoppzeit auf das Maximum von 36.000 Sekunden aufgezeichnet werden sollen. Erwerben Sie einfach gefärbte Kontrollen für benutzerdefinierte konjugierte Antikörper, die im Multicolor-Panel enthalten sind, und für den funktionellen Farbstoff Indo-1.

Geben Sie 50 Mikromol Ionomycin in die calciumgebundene Indo-1-Positivkontrolle und den Vortex. Fügen Sie das Durchflussrohr zur Probeninjektionsplatine hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen. Fügen Sie dann dem Durchflusszytometer eine kalziumfreie Indo-1-Negativkontrolle hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen.

Heben Sie die Mischung der einfach gefärbten Steuerelemente auf, indem Sie auf die Schaltfläche "Unmix" klicken. Sobald das Entmischen abgeschlossen ist, erstellen Sie sequenzielle Diagramme mit dem Arbeitsblatt Ungemischt, z. B. SSCA versus FSCA zum Entfernen von Ablagerungen aus der Probe und SSCA versus SSCH zum Entfernen von Dubletten.

Erstellen Sie dann Gates, indem Sie auf Plotten klicken. Fügen Sie dem Arbeitsblatt ein Diagramm hinzu, und doppelklicken Sie in das Tor, um eine nachgelagerte Gated Population zu erstellen. Fahren Sie fort, bis alle interessierenden Grundgesamtheiten berücksichtigt sind. Erwärmen Sie anschließend die zuvor vorbereiteten einfach gefärbten Kontrollproben auf 37 Grad Celsius für die sequentielle Analyse.

Richten Sie die Durchflusszytometrie-Software ein und lassen Sie deionisiertes Wasser 2 bis 3 Minuten lang laufen, um die fluidische Stabilität des Durchflusszytometers zu gewährleisten. Richten Sie sequenzielle Diagramme auf dem ungemischten Arbeitsblatt ein, indem Sie mit den Schaltflächen für das Polygon-, Rechteck- oder Ellipsen-Tor Tore erstellen, um die gewünschte Grundgesamtheit einzuschließen.

Doppelklicken Sie in das Gatter, und ändern Sie die Parameter der Y- und X-Achse in SSCA statt SSCH. Schließen Sie die Definition der Achsenparameter ab, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Achse klicken. Erstellen Sie ein Diagramm mit dem Signal SSCA versus Viabilitätsfarbstoff. Gate die lebenden Zellen, die negativ oder mit Aminfarbstoffen gefärbt sind.

Lebende Zellen, die für die Färbung von lebenden Toten negativ sind, häufen sich an der Nullmarkierung sowohl auf der y- als auch auf der x-Achse. Doppelklicken Sie auf das innere Diagramm, um ein neues Diagramm zu erstellen, das nur einzellige lebende Lymphozyten enthält. Ändern Sie die y-Achse auf der x-Achse in eins über die Zeit, um den Kalziumeinstrom zu visualisieren.

Legen Sie anschließend die erwärmte biologische Probe in das SIT der Maschine. Führen Sie die Proben bei 2.500 bis 3.000 Ereignissen pro Sekunde bei mittlerer Flussrate durch, um den Kalziumeinstrom in einer begrenzten Anzahl von Zellpopulationen zu visualisieren. Gib den nächsten Schlauch in das Perlenbad.

Drücken Sie in der Erfassungssteuerung die Aufnahmetaste, um die Anfangsdaten 30 Sekunden lang aufzuzeichnen und so einen basalen Kalziumsignalwert in der Probe zu erhalten. Klicken Sie dann auf Stopp und entfernen Sie das Röhrchen aus der Probeninjektionsöffnung. Geben Sie 30 Mikrogramm unkonjugiertes Anti-CD3 direkt in das Probenröhrchen, um den Kalziumeinstrom zu initiieren.

Setzen Sie das Röhrchen schnell wieder auf die Probeninjektionsöffnung und drücken Sie in der Software auf Aufnahme. Zeichnen Sie die Daten sieben Minuten lang auf und beobachten Sie die verstrichene Zeit unter den Erfassungssteuerungen in der Software. Drücken Sie dann in der Software auf Stopp.