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Immunologie
0 Aufrufe • 4:21 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie natürliche Killerzellen oder NK-Zellen. Fügen Sie Lentivirus-Vektoren hinzu, die aus viralen Enzymen und manipulierten RNA-Molekülen bestehen, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren.
Fügen Sie kationische Polymere hinzu und sedimentieren Sie die Zellen und Viren.
Die Polymere neutralisieren die negativen Ladungen sowohl auf dem Virus als auch auf der Zelle und erleichtern so die Membranfusion.
Die RNA wird in DNA revertiert und in das Wirtsgenom integriert, wodurch die Expression fluoreszierender Proteine ermöglicht wird.
Fügen Sie Medien hinzu, die mit dem Zytokin Interleukin-2 oder IL-2 ergänzt sind.
IL-2 löst eine intrazelluläre Signalübertragung aus, die das Überleben und die Proliferation von NK-Zellen fördert und gleichzeitig die Transgenexpression beibehält.
Übertragen Sie die Mischung auf eine gut beschichtete Beschichtung, die mit Antikörpern beschichtet ist, die an spezifische Immunrezeptoren auf NK-Zellen binden und diese dazu veranlassen, antivirale Zytokine freizusetzen.
Quantifizieren Sie die freigesetzten Zytokine, um den Einfluss des Polymers auf die Zytokinproduktion zu bewerten.
Fügen Sie Fluoreszenzfarbstoffe hinzu, um die DNA nekrotischer Zellen zu markieren.
Identifizieren Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie lebende Zellen und quantifizieren Sie das Signal des fluoreszierenden Proteins, um die Effizienz der polymerinduzierten Transduktion zu messen.
Suspendieren Sie primäre NK-Zellen von Mäusen oder Menschen in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte bei 0,5 x 105 pro Milliliter Medium mit GFP-Lentivirus-Überstand bei einem MOY von 5, 10 und 20 und in Gegenwart von Polybren, Protaminsulfat oder Dextran.
Zentrifugieren Sie die Platten bei 1.000 mal g für 60 Minuten. Kultivieren Sie die Zellen dann, ohne den Überstand zu dekantieren, über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, der mit 5,2 % Kohlendioxid infundiert ist. Nachdem die Zellen mit 10 Millilitern PBS gewaschen wurden, verwenden Sie 2 Milliliter RPMI 1640 Medium mit IL-2, um die Zellen zu resuspendieren.
Beschichten Sie am Tag vor der Entnahme der Zellen 96-Well-Polystyrolplatten mit hochgradig proteinabsorbierenden Polystyrolplatten mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter monoklonaler Anti-NKG2D-Antikörper und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank. Verwenden Sie am nächsten Tag 100 Mikroliter PBS, um jede Mulde dreimal gut zu waschen.
Ernten Sie die transduzierten NK-Zellen, indem Sie zuerst vorsichtig auf die Platten klopfen. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platten. Verwenden Sie 16 bis 18 Stunden nach der Aktivierung eine Mehrkanalpipette, um die Überstände zu sammeln. Generieren Sie dann mit den rekombinanten Zytokinen aus einem ELISA-Kit eine Standardkurve und quantifizieren Sie die Zytokine wie Interferon-gamma im Überstand.
Um die Lebensfähigkeit der NK-Zellen zu testen, waschen Sie die Zellen vier Tage nach der Transduktion zweimal mit 10 Millilitern kaltem PBS. Ernten Sie dann die Zellen und verwenden Sie ein Annexin-V/7-Amino-Actinomycin D, um sie zu färben. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um den Prozentsatz der nekrotischen Zellen unter den transformierten NK-Zellen zu bestimmen, und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll.