Name: Erkennung von Histon-Modifikationen in Pflanzenblättern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zur Erkennung von Histon-Modifikationen in Arabidopsis-Genen. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in molekulare Mechanismen der Genregulation in Pflanzen.

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<p class="jove_content"> Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und der Exzellenzinitiative der deutschen Bundesregierung und der Länder gefördert. </p>

<p class="jove_title"> 1. Die Vernetzung von Pflanzenmaterial </p><ol><li> Ernte-1-2g Arabidopsis Blättern (6 bis 10cm Rosette Durchmesser) in einem 50-ml Plastikröhrchen und füllen bis zu 40ml mit Vernetzung Puffer. </li><li> Stellen Sie sicher, Blätter bleiben eingetaucht, zum Beispiel durch Füllung eine maßgeschneiderte Filterschwamm oben rechts Puffer Oberfläche. Dann legen Sie die Röhrchen in einem Exsikkator. </li><li> Vakuum für 10 Minuten zu infiltrieren. Zu jedem Röhrchen add 2,5 ml 2M Glycin, um die Vernetzung zu stoppen und umzukehren Rohre gleich Dispersion von Glycin zu rechtfertigen. </li><li> Vacuum weitere 5min zu infiltrieren und zu verwerfen Flüssigkeit während der Ernte lässt auf ein Sieb. </li><li> Wash Blätter zweimal mit 1 l Wasser in ein Becherglas, dann trockene Blätter gründlich mit Küchenpapier. </li><li> Sammeln Sie Laub in einem frischen Kunststoffrohr und frieren in flüssigem Stickstoff. Shop Blätter bei -80 ° C bis Chromatin isoliert. </li></ol><p class="jove_title"> 2. Isolierung von Chromatin </p><ol><li> Blätter wurden mit Mörtel und Stempel, die in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung aufbewahrt wurden Boden. </li><li> Transfer-Pulver zu einem 50-mL Plastikröhrchen und suspendieren in 30 mL Extraktionspuffer Nr. 1. </li><li> Inkubieren 15min bei 4 ° C auf einem Überkopfschüttler. </li><li> Filtrat Suspension durch vier Schichten Miracloth in ein frisches 50-mL Plastikröhrchen. </li><li> Spin für 20min bei 2.800 xg bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und Suspend-Pellet mit einem Pinsel in 1ml Extraktionspuffer # 2. Fügen Sie zunächst ein kleines Volumen von Puffer Nr. 2, dann auszusetzen Pellet mit einem Pinsel, und fügen Sie dann den Rest des Puffers. </li><li> Transfer-Suspension auf eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Spin für 10min bei 12.000 xg bei 4 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten 2ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 ml Extraktionspuffer Nr. 3. </li><li> Entfernen Sie aus dem gesponnen Rohr (Schritt 2,7) Überstand und Pellet in auszusetzen 300μL Extraktionspuffer Nr. 3. Fügen Sie zunächst ein kleines Volumen von Puffer Nr. 3, auszusetzen Pellet mit einem Pinsel, und fügen Sie dann die restlichen Puffer. </li><li> Sorgfältig pipettieren des suspendierten Pellets (Schritt 2,9) auf der Oberseite des 1,5 ml Extraktionspuffer Nr. 3 in Schritt 2,8 zubereitet. Achten Sie darauf, die beiden Phasen nicht zu vermischen. Spin für 1h bei 16.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und Suspend Chromatin Pellet mit einem Pinsel in 300μL der Beschallung Puffer. </li><li> Ultraschallbad Chromatin mit einer Sonotrode, oder in einem Ultraschallbad, um eine DNA-Größe von ca. 400bp. Als Beschallung, stellen Sie sicher, Chromatin nicht über ca. 30 ° C erhitzt werden, um wärmeempfindlichen Vernetzungen zu schützen. Die Dauer der Beschallung muss experimentell bestimmt werden, da es deutlich variiert zwischen den verschiedenen Ultraschall-Geräten. Zur Orientierung sind die Einstellungen für zwei verschiedene Geräte zur Verfügung: </li></ol><p class="jove_content"> Für Beschallung mit einem Bandelin Marke Sonotrode aussetzen Chromatin in 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen fünfmal bis 20 Ausbrüche mit den Einstellungen 25% Leistung, Zyklus = 50. Während dabei kühl Probe nach 20 <sup>th</sup> platzt in ein Eisbad. </p><p class="jove_content"> Für Beschallung mit einem Diagenode Bioruptor Ultraschallbad, füllen Bad mit Wasser und Eis und beschallen zehnmal für 30 Sekunden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit der Einstellung "hoch". Nach 30 Sekunden, kühlen Proben für weitere 30 Sekunden. </p><ol start="13"><li> Spin beschallten Probe für 5 min bei 16.000 g bei 4 ° C zu fällen ungelöstes Material. Der Überstand kann direkt für die Immunpräzipitation eingesetzt werden. Alternativ können die Proben Schock in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung werden. </li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunpräzipitation </p><ol><li> Bereiten Sie 2-mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 40 ul Protein-A Agarose und 1,8 ml der Antikörper-Bindungspuffer. Add 200 ul des Chromatins Vorbereitung (Schritt 2,13). </li><li> Die Röhrchen für 1 Stunde auf einem Überkopfschüttler. </li><li> Discard-Protein-A Agarose-Beads und die Nutzung für die Immunpräzipitation Überstand. </li><li> Entfernen eines 40 ul-Aliquot auf Chromatin-Konzentration ("Input") zu bestimmen. </li><li> Add 30μL Protein-A-Agarose und die Höhe der Änderung-spezifischen Antikörper, die in der unten stehenden Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte für 400μL beschallt Chromatin Federung angegeben ist. </li><li> Inkubieren 2.5h oder über Nacht auf einem Überkopfschüttler bei 4 ° C. </li><li> Spin down Perlen für 2min bei 440 x g. </li><li> Wash Bead-Pellet mit 900μL von jedem Waschpuffer (siehe Liste unten). Für jeden Puffer inkubieren Perlen in den Puffer für 10min auf einem Überkopfschüttler bei 4 ° C, dann für 2min Spin bei 440 xg, Überstand verwerfen, und fügen Sie den nächsten Puffer. <ol><li> Low Salz Waschpuffer </li><li> Hohe Salz Waschpuffer </li><li> LiCl Waschpuffer </li><li> TE Waschpuffer </li></ol></li><li> Nach dem letzten Waschen vollständig entfernen Sie alle verbleibenden Puffer. </li></ol><p class="jove_title"> 4. De-Vernetzung von Histonen und DNA, und Aufreinigung von DNA ausgefällt </p><ol><li> Add 100 &amp;mgr; von de-Vernetzung Puffer, um die Agarose Pellet und 40 ul 'Eingang' Probe aus Schritt 3.4, Mix für 5min auf einem Vortex-Mixer, Spin Proben und InkubationDebatte bei 65 ° C über Nacht. </li><li> Purify DNA mit einem kommerziellen DNA oder PCR Purification Kit. </li><li> Typischerweise 5μl einer 1:5-Verdünnung der letzten Spalte Eluat sind ausreichend, um durchzuführen konventionellen Locus-spezifischen real-time quantitative RT-PCR (RT-qPCR). </li></ol><p class="jove_title"> 5. Tabelle der Puffer </p><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Crosslinking-Puffer</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyrat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> 3% (v / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Extraktionspuffer Nr. 1</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyrat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 400mm </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> Komplette Protease Inhibitor </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Extraktionspuffer # 2</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyrat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 250 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Komplette Protease Inhibitor </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Extraktionspuffer # 3</strong> </td></tr><tr><td> Natriumbutyrat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 1,7 Mio. </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2</sub> </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,15% (w / v) </td></tr><tr><td> Komplette Protease Inhibitor </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Beschallung Puffer</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 25mM </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,5% (w / v) </td></tr><tr><td> Komplette Protease Inhibitor </td><td> 1x </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Antikörper Bindungspuffer</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 50mM </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Low Salz Waschpuffer</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Hohe Salz Waschpuffer</strong> </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 2mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>LiCl Waschpuffer</strong> </td></tr><tr><td> Lithiumchlorid </td><td> 250 mM </td></tr><tr><td> Nonidet-P40 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>TE Waschpuffer</strong> </td></tr><tr><td> EDTA-NaOH, pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td> 1mM </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>Decrosslinking Puffer</strong> </td></tr><tr><td> Tris-HCl, pH 6,8 </td><td> 62.5mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 10 mM </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> 6. Repräsentative Ergebnisse: </p><p class="jove_content"> Die Expression des <em>Arabidopsis thaliana PR2</em> Verteidigung Gen für ein β-1,3-Glucanase mit antimikrobieller Wirkung <sup>12,</sup> wurde von Benzothiadiazol (BTH), ein synthetisches Analogon des Pflanzenhormon Salicylsäure <sup>3</sup> induziert. <strong>Abbildung 1</strong> zeigt, dass die Aktivierung von <em>PR2</em> Ausdruck ist mit einem Anstieg bei der Acetylierung von Lysin-Resten auf Histon-assoziierten H3 und H4 auf den <em>PR2</em> Promotor. Da Nukleosomen Dichte nimmt während Genaktivierung <sup>13</sup> wurden Histonacetylierung Werte für das Signal mit einem Antikörper gegen eine Invariante Region von Histon 3 erhaltenen normalisiert. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"><br> <strong>Abbildung 1 BTH induziert Histon-Acetylierung auf die <em>PR2-Promotors</em> in Arabidopsis.</strong> Die Pflanzen wurden mit 100 &amp;mgr; BTH oder ein Spritzpulver Kontrolle behandelt. Nach 72h wurden Blätter gesammelt und Chromatin isoliert wurde. Das Signal nach der Fällung mit Acetylierung-spezifischen Antikörpern (wie in der Abbildung angegeben) erhalten wurde, um das Signal durch Fällung mit einem Antikörper erhalten, um eine Invariante Domain von Histon H3 normalisiert. Gefällte Chromatin wurde mittels RT-qPCR quantifiziert. Die Daten werden standardisiert für Histonmodifikationen Ebenen in der Abwesenheit von BTH-Behandlung. </p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content"> Keine Interessenskonflikte erklärt. </p>

<p class="jove_content"> Die meisten kritischen Schritte in dem Protokoll sind die Vernetzung von DNA und Histonen, die Art und Menge der Blattmaterial, Schleifen des Materials und die Beschallung von Chromatin. Für eine detailliertere Erörterung dieser Probleme finden Sie unter refs. 9 und 10. </p><p class="jove_step"> Beschallung und Vernetzung: </p><p class="jove_content"> Es ist wichtig, Chromatin während der Beschallung auf Fragmente von ca. 400bp zu stören. Dank intensiver Beschallung wird Chromatin durch Unterbrechung der DNA und Histonen zu zerstören, während unzureichende Beschallung lange Chromatinfragmenten verlassen wird. Diese beeinflussen die Spezifität der Methode, weil Histon-Modifikationen distal von den getesteten locus keine lokalen Änderungen benachteiligt werden. Beschallung Effizienz am besten durch das Sammeln von 20 &amp;mgr; l Chromatin von Proben vor und nach Beschallung, de-Vernetzung DNA und Histonen, Isolierung der DNA und die Bestimmung der Länge der DNA geschert durch Agarosegelelektrophorese überprüft. RNAse sollte, um die Proben vor der Elektrophorese hinzugefügt werden, da das Chromatin Vorbereitung enthält noch große Mengen an RNA in diesem Stadium der Reinigung, die mit der Visualisierung von fragmentierten DNA stören könnten. Die Proben werden für Chromatinimmunpräzipitation nützlich, wenn DNA aus nicht geschert Chromatin ist länger als 10kbp, während DNA aus geschert Chromatin bildet ein Abstrich mit maximaler Signalstärke um 400bp DNA. </p><p class="jove_content"> Wir verwenden routinemäßig 3% (v / v) Formaldehyd für Chromatin Vernetzung in intakten Blättern, aber 1% (v / v) Formaldehyd könnte in den meisten Fällen ausreichend. In unsere Hände, damit eine niedrige Formaldehyd-Konzentrationen für kürzere Zeiten Beschallung und Hintergrund-Signale in Folge PCR-Reaktionen. Allerdings, unzureichende Mengen an Formaldehyd oft in geringen Reproduzierbarkeit der PCR-Signal zwischen unabhängigen Experimenten führen. Dies könnte durch unzureichende Durchdringung der Blätter mit Formaldehyd bei niedrigen Konzentrationen. Achten Sie auf Ihre Formaldehyd Lager häufig austauschen, wie die Verbindung neigt dazu, sich mit der Zeit polymerisieren. Formaldehyd-Lösungen sind nur für etwa einen Monat stabil, und diese Zeit ist kaum von Methanol Stabilisierung verlängert. Es wird empfohlen, verschiedene Formaldehyd-Konzentrationen Test beim Einrichten experimentellen Bedingungen. </p><p class="jove_step"> Betrag von Pflanzenmaterial und Schleifen: </p><p class="jove_content"> Es ist wichtig zu geringe Mengen an Blattmaterial in einem großen Volumen an Puffer zu infiltrieren, um Blätter aneinander kleben zu vermeiden. Blatt kleben oft in unzureichender Infiltration von Formaldehyd. Darüber hinaus wird zu viel Pflanzenmaterial Block Poren der Miracloth Gewebe. Die Mahleffizienz hängt wesentlich mit einem Mörser und Stößel mit einer perfekten Passform. Wir routinemäßig mahlen mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser in Abwesenheit von zusätzlichen flüssigen Stickstoff dreimal für 50 Sekunden, bis das Material zu einem feinen Pulver gemahlen wird. </p>

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Protein-A-Agarose </td><td> Roche </td><td> 11 134 515 001 </td><td> abhängig von der Antikörper-Klasse </td></tr><tr><td> Protein-G-Agarose </td><td> Roche </td><td> 11 243 233 001 </td><td> abhängig von der Antikörper-Klasse </td></tr><tr><td> Anti-hyperacetyl-H4 </td><td> Millipore </td><td> 06-946 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H4K5 </td><td> Millipore </td><td> 07-327 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H4K8 </td><td> Millipore </td><td> 07-328 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H4K12 </td><td> Millipore </td><td> 07-595 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H4K16 </td><td> Millipore </td><td> 07-329 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H4K18 </td><td> Millipore </td><td> 07-354 </td><td> verwendeten wir 1μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H3K9 </td><td> Millipore </td><td> 07-352 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Acetyl-H3K14 </td><td> Millipore </td><td> 07-353 </td><td> verwendeten wir 1μL </td></tr><tr><td> Anti-trimethyl-H3K4 </td><td> Diagenode </td><td> PAB-003 bis 50 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-dimethyl-H3K4 </td><td> Millipore </td><td> 07-030 </td><td> verwendeten wir 5μL </td></tr><tr><td> Anti-Monomethyl-H3K4 </td><td> Abcam </td><td> ab8895 </td><td> 2,5-10 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> Anti-H3 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td><td> verwendeten wir 1μL um Histon-Dichte zu überprüfen </td></tr><tr><td> Bioruptor </td><td> Diagenode </td><td> UCD-200 an </td><td></td></tr><tr><td> Sonotrode MS72 </td><td> Bandelin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miracloth </td><td> Calbiochem </td><td> 475855 </td><td></td></tr><tr><td> Komplette Protease Inhibitor </td><td> Roche </td><td> 11836145001 </td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von histon-modifikationen in pflanzenblättern

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content"> Chromatin-Struktur ist für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten wichtig. In diesem Prozess spielen die Chromatin-Remodeling, DNA-Methylierung und kovalente Modifikationen an der Amino-terminalen Enden der Histone H3 und H4 wesentliche Rollen <sup>1-2.</sup> H3 und H4 Histon-Modifikationen zählen die Methylierung von Lysin und Arginin, Acetylierung von Lysin und Phosphorylierung von Serin-Resten <sup>1-2.</sup> Diese Änderungen sind entweder mit Genaktivierung, Unterdrückung oder eine grundierte Stand der Gen, das eine schnellere und eine starke Aktivierung des Ausdrucks unterstützt nach Wahrnehmung der entsprechenden Signale (Mikrobe-associated molecular patterns, Licht, Hormone, etc.) <sup>3-7</sup> verbunden. </p><p class="jove_content"> Hier stellen wir ein Verfahren zur zuverlässigen und empfindlichen Nachweis von spezifischen Chromatin-Modifikationen auf ausgewählte pflanzliche Gene. Die Technik basiert auf der Vernetzung von (modifizierten) Histone und DNA mit Formaldehyd <sup>8,9,</sup> Extraktion und Beschallung von Chromatin, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) mit Modifikation-spezifische Antikörper <sup>9,10</sup> basiert, de-Vernetzung von Histon-DNA-Komplexe und Gen-spezifischen real-time quantitative PCR. Der Ansatz hat sich zum Nachweis von spezifischen Histon-Modifikationen mit C <sub>4</sub> Photosynthese in Mais <sup>5,11</sup> und systemische Immunität in Arabidopsis <sup>3</sup> zugeordnet nützlich. </p>

<p class="jove_content">Eine zuverlässige und nützlicher Ansatz zur Histon-Modifikationen auf spezifische Pflanzen-Gene erkennen beschrieben. Der Ansatz kombiniert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) und real-time quantitative PCR. Es ermöglicht den Nachweis von Histon-Modifikationen auf bestimmte Gene mit eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen.</p>

Erkennung von Histon-Modifikationen in Pflanzenblättern

Die Chromatinstruktur ist entscheidend für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten. Bei diesem Prozess spielen das Chromatin-Remodeling, die DNA-Methylierung und kovalente...

<p>Die folgende Methode ermöglicht den zuverlässigen und empfindlichen Nachweis spezifischer Chromatin-Modifikationen an ausgewählten Pflanzengenen. Vernetzen Sie zunächst modifizierte Histone und DNA mit Formaldehyd. Anschließend extrahieren und sonifizieren Sie das Chromatin, um die Immunpräzipitation mit modifications-spezifischen Antikörpern zu erleichtern.</p><p>Analysieren Sie abschließend die Chip-Reaktion durch die Vernetzung von Histon-DNA-Komplexen und die genomspezifische Echtzeit-quantitative PCR. Bei Pflanzen kann dieser Ansatz molekulare Erkenntnisse liefern, wie beispielsweise die spezifischen Histon-Modifikationen, die mit der C4-Photosynthese bei Mais und der systemischen Immunität bei Arabidopsis assoziiert sind. Der Hauptvorteil der Chromatin-Immunpräzipitation gegenüber bestehenden Methoden wie der Mars-Spektrometrie besteht darin, dass mit dieser Technik die Detektion von Histon-Modifikationen an ausgewählten Sequenzen im Pflanzengenom ermöglicht wird.</p><p>Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da das Protokoll mehrere Schritte umfasst, deren korrekte Durchführung entscheidend für den Erfolg des Verfahrens ist. In diesem Video verwenden wir eine Chip-Analyse, um Einblicke in die Fehlregulation der Genexpression in der Modellpflanze Arabidopsis ANA zu erhalten, und demonstrieren das Verfahren mit Mic Yakovich, einem Doktoranden. Beginnen Sie für jede Probe mit der Gewinnung von zwei Gramm Arabidopsis-Blättern in einem 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Füllen Sie den Puffer bis zur 40-Milliliter-Marke mit Vernetzungs-Puffer auf und platzieren Sie einen angepassten Filterschwamm direkt über der Pufferoberfläche, um sicherzustellen, dass die Blätter vollständig benetzt bleiben.</p><p>Stellen Sie die Proben nun unter Vakuum in einen Exsikkator und filtrieren Sie 10 Minuten lang. Um die Vernetzungsreaktion zu stoppen, geben Sie 2,5 Milliliter zweimolares Glycin hinzu und mischen durch mehrmaliges Umstülpen. Anschließend erneut fünf Minuten lang infiltrieren, weiterhin unter Vakuum setzen und weitere fünf Minuten infiltrieren.</p><p>Danach die Flüssigkeit verwerfen und die Blätter auf einem Sieb sammeln. Nachdem die Blätter zweimal mit einem Liter Wasser in einem Plastikbecher gewaschen wurden, die Blätter gründlich mit Papiertüchern trocknen, in einem frischen Plastikröhrchen sammeln und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Die Proben bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die Chromatinisolierung erfolgt.</p><p>Die gefrorenen Proben mit einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zermahlen. Das Pulver in ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr überführen. Das Pulver in 30 Milliliter Extraktionspuffer Nummer eins suspendieren und 15 Minuten bei vier Grad Celsius auf einem Überkopfschüttler inkubieren.</p><p>Lassen Sie die Suspension durch vier Lagen Spiegelgewebe in ein frisches 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen laufen. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie das Überstand. Lösen Sie das Pellet anschließend mit einem Pinsel in 50&nbsp;Mikrolitern Extraktionspuffer Nummer zwei auf und geben Sie weitere 950&nbsp;Mikroliter Extraktionspuffer hinzu.</p><p>Schritt zwei: Überführen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 1,5 Milliliter Extraktionspuffer vor. Schritt drei.</p><p>Danach die Überstände verwerfen, um das Pellet schrittweise in 300 Mikrolitern Extraktionspuffer zu suspendieren. Nummer drei. Zunächst eine kleine Menge Puffer hinzufügen.</p><p>Schritt drei: Das Pellet mit einem Pinsel suspendieren und dann den restlichen Puffer hinzufügen. Nun die Proben vorsichtig auf die vorbereiteten Röhrchen mit 1,5 Milliliter Extraktionspuffer schichten. Schritt drei: Sicherstellen, dass sich die beiden Phasen nicht vermischen, und die Proben eine Stunde bei 16.000 × g und 4 °C zentrifugieren.<p>Entsorgen Sie das Überstand und suspendieren Sie das Chromatinpellet mit einem Pinsel in 300 µL Sono­ka­tions­puffer. Sono­zieren Sie das Chromatin auf eine DNA-Größe von etwa 400 Basenpaaren. Achten Sie während der Sono­ka­tion darauf, dass das Chromatin nicht über etwa 30 °C erwärmt wird. Um wärmeempfindliche Vernetzungen zu schützen, zentrifugieren Sie die sonoziierte Probe, um unlösliches Material auszufällen, und gewinnen Sie den Überstand in 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen, die Protein-Agarose und Antikörper-Bindungspuffer enthalten.</p><p>Fügen Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten Chromatinprobe hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang auf einem Überkopfschüttler. Nach der Zentrifugation gewinnen Sie die Überstände der Probe und portionieren 30 Mikroliter Protein.</p><p>Geben Sie jeweils 1,5 Milliliter frische Röhrchen für die Bestimmung der Chromatin-Konzentration des Input-Materials vor. Heben Sie 40 Mikroliter des sonifizierten Chromatins zurück. Geben Sie anschließend 400 Mikroliter der sonifizierten Chromatin-Suspension zu 30 Mikrolitern Protein-Aros und einer geeigneten Menge an modificationspezifischem Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Kopfschüttler.</p><p>Die Perlen durch Zentrifugation zwei Minuten bei 440 × g sammeln. Das Überstand entfernen und anschließend mehrere Waschschritte mit jeweils 900 µL des jeweiligen Puffers durchführen, wobei die Pellets der Perlen jeweils 10 Minuten auf einem Überkopfschüttler behandelt werden. Nach dem letzten Waschschritt jeglichen verbleibenden Puffer vollständig entfernen. Um die DNA von den Histonen zu lösen, 400 µL Desvernetzungspuffer zu den Perlen sowie zur zuvor aufbewahrten 40-µL-Eingabeprobe geben, fünf Minuten vortexen, die Proben zentrifugieren und über Nacht bei 65 °C inkubieren.</p><p>Reinigen Sie nun die DNA mit einem kommerziellen DNA-Reinigungs-Kit und führen Sie eine konventionelle, locus-spezifische Echtzeit-quantitative RT-PCR durch. In diesem Beispiel wurde die Expression des Arabidopsis-ANA-PR-2-Abwehrgens durch Benzoldiazol, ein synthetisches Analogon des Pflanzenhormons Salicylsäure, induziert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung der PR-2-Expression mit einer Zunahme der Acetylierung von Lysinresten an den Histonen H3 und H4 am PR-2-Promotor assoziiert ist.</p><p>Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Zugabe von Extraktionspuffer eins zum Blattpulver einen Überdruck im geschlossenen Fcon-Röhrchen verursacht. Bitte öffnen Sie das Röhrchen regelmäßig. Außerdem sollten Sie den Pinsel erst nach der Suspension der Pellets und vor der Zugabe des nächsten Puffers nicht entfernen.</p><p>Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Histonmodifikationen und Promotorregionen mithilfe der auf Formaldehyd basierenden Vernetzung von DNA und Histonen, der Isolierung von Chromatin mittels Immunpräzipitation und der lokusspezifischen DNA-Quantifizierung bestimmt, um zentrale Fragen zur Rolle des Chromatins und seiner Modifikationen in verschiedenen Bereichen der Pflanzenbiologie zu beantworten.</p>

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.

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Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

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