Orale Verabreichung von transformierten Hefezellen in das intestinale Immunsystem der Maus

Beginnen Sie mit einem Röhrchen zum Einnehmen, das eine Suspension von genetisch transformierten, auxotrophen Hefen enthält, die nicht in der Lage sind, Uracil-Nukleobase zu produzieren.

Führen Sie den oralen Schlauch in den Mund einer gefesselten Maus ein und führen Sie ihn zum Magen.

Verabreichen Sie die Hefesuspension direkt in den Magen, so dass sie schließlich den Dünndarm erreichen kann.

Der Dünndarm enthält Epithelzellen, darunter befinden sich Peyer-Flecken, die reich an Immunzellen sind.

Mikrogefaltete Zellen, spezialisierte Darmepithelzellen in der Nähe der Peyer-Pflaster, verschlingen die Hefezellen und verinnerlichen sie in Vesikel.

Diese Vesikel bewegen sich durch die Zellen und geben Hefezellen in das darunter liegende Peyer-Pflaster ab.

Isolieren Sie das Peyer-Pflaster aus dem getöteten Mausdarm und erhalten Sie eine gleichmäßige Zellsuspension.

Kulturieren Sie diese Zellsuspension auf einem hefeselektiven Medium, das Uracil enthält.

Auxotrophe Hefe nutzt das Uracil und vermehrt sich, um Kolonien zu bilden, was die Abgabe von transformierten Hefezellen in das intestinale Immunsystem der Maus bestätigt.

Nach der Vorbereitung der Hefekulturen gemäß dem Textprotokoll wird die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer bestimmt und auf 10 bis neunte Zellen pro Milliliter eingestellt. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2.500 mal g für drei Minuten. Gießen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die entsprechende Menge sterilen Wassers hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren.

Befestigen Sie eine Sondennadel mit geeigneter Stärke auf einer sterilen 1-Milliliter-Spritze und laden Sie die Hefeprobe, um Luftblasen zu entfernen. Laden Sie eine zusätzliche Spritze mit sterilem Wasser, um die Kontrollmäuse zu sondieren. Nehmen Sie mit der nicht dominanten Hand die Maus, die gegappt werden soll, und fassen Sie mit Zeigefinger und Daumen die Haut um den Hals fest. Stecke den Schwanz unter den kleinen Finger. Stellen Sie sicher, dass der Griff fest sitzt und die Maus ihren Kopf nicht bewegen kann.

Führen Sie anschließend die Sondennadel vorsichtig in die Speiseröhre der Maus ein, indem Sie die Nadel entlang des Gaumens und des Rachenraums anwinkeln und dabei leicht links von der Mitte halten. Warten Sie, bis die Maus den Nadelknollen verschluckt hat. Wenn ein Widerstand zu spüren ist oder die Maus nach Luft schnappt, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und versuchen Sie erneut, die Speiseröhre zu finden.

Nachdem die Maus den Knollen der Sondennadel verschluckt hat, drücken Sie vorsichtig auf den Spritzenkolben, um die Hefe direkt in den Magen der Maus zu verabreichen. Entfernen Sie vorsichtig die Sondennadel aus dem Magen und der Speiseröhre der Maus und setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein. Überprüfen Sie, ob die Maus normal atmet und sich bewegt, um sicherzustellen, dass die Sonde ordnungsgemäß durchgeführt wurde.

Nachdem Sie die Maus gemäß dem Textprotokoll geopfert haben, positionieren Sie sie mit vollständig freiem Bauch und verwenden Sie 70% Ethanol, um den Bauchbereich zu besprühen. Machen Sie mit einer Schere einen Querschnitt durch das Fell und die Haut. Hebeln Sie dann den Schnitt manuell auf, um das Peritoneum, die dünne Seros-Auskleidung, die die Bauchorgane bedeckt, weiter freizulegen. Heben Sie das Bauchfell vorsichtig an und machen Sie einen Querschnitt, um den Darm freizulegen.

Verwenden Sie dann eine stumpfe Pinzette, um den Dünndarm vorsichtig von den Mesenterialarterien, dem Fett und anderen Geweben wegzuführen. Setzen Sie den Dünndarm vom Magen aus im oberen linken Quadranten des Mäusebauchs dem Blinddarm aus, der großen Tasche aus Darmgewebe am Anfang des Dickdarms.

Isolieren Sie als Nächstes Peyer-Flecken, indem Sie entlang des Dünndarms nach 1 bis 2 Millimeter großen, etwa kreisförmigen Flecken aus undurchsichtigem Gewebe suchen. Schneiden Sie dann mit einer gebogenen Präparierschere die Kuppel des Peyer-Pflasters ab und lassen Sie Ränder übrig, um sicherzustellen, dass kein umgebendes Gewebe entnommen wird.

Übertragen Sie die sezierten Peyer-Patches in vollständiges IMDM. Gießen Sie dann die Lösung mit den suspendierten Peyer-Pflastern auf ein 40-Mikrometer-Zellensieb. Nachdem Sie die Peyer-Pflaster mit vollständigem IMDM gewaschen haben, verwenden Sie einen Kolben aus einer 1-Milliliter-Spritze, um das Gewebe vorsichtig aufzubrechen und die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln. Pelletieren Sie die gespannten Zellen sieben Minuten lang bei 1.800 U/min. Warten Sie dann und analysieren Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll.