Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten zerebralen Organoiden

Nehmen Sie Kolonien von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die auf einer Stützmatrix kultiviert werden.

Fügen Sie eine Lösung hinzu, die Enzyme enthält, um die Kolonien in einzelne Zellen zu dissoziieren.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen, zentrifugieren Sie sie und entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die iPSCs in einem Wachstumsmedium.

Übertragen Sie die Zellen in eine Mikroplatte, die biokompatible Polymerfasern enthält.

Zentrifugieren Sie, um iPSCs auf dem Polymergerüst zu aggregieren und Embryoidkörper oder EBs zu bilden.

Übergang zu einem neuronalen Induktionsmedium, das die Proliferation und Differenzierung von iPSCs in neurale Stammzellen, Vorläuferzellen und unreife Neuronen fördert.

Nach der Inkubation durchlaufen die Zellen eine Selbstorganisation.

Legen Sie die Embryoidkörper auf ein Noppenblatt und fügen Sie Tropfen hinzu, die Proteine der extrazellulären Matrix enthalten.

Inkubieren Sie, um die Matrix zu verfestigen und die EBs einzubetten.

Übertragen Sie die EBs in eine Mikroplatte, die ein neuronales Erhaltungsmedium enthält. Ausbrüten.

Die EBs durchlaufen eine zelluläre Proliferation, um Vorsprünge und Knospen zu bilden und sich zu reifen Neuronen zu differenzieren, die zerebrale Organoide bilden.

Aspirieren Sie das Medium mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS. Fügen Sie dann 500 Mikroliter Zellablösungslösung oder 0,5 millimolare EDTA hinzu, um die Kolonien zu dissoziieren, und inkubieren Sie 3 bis 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 1 Milliliter frisches E8-Medium in jede Vertiefung und pipettieren Sie vorsichtig, um alle Zellen zu lösen.

Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15-Millimeter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie weitere 1 Milliliter frisches E8-Medium hinzu. Schleudern Sie dann die Zellen bei 290 g für 3 Minuten bei Raumtemperatur herunter.

Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet in 1 Milliliter E6-Medium, ergänzt mit 50 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, resuspendiert und die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt

Bereiten Sie eine Zellsuspension mit der gewünschten Sitzdichte in E6-Medien vor, die mit dem ROCK-Inhibitor ergänzt wird. Geben Sie dann 150 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Anheften.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte bei 290 g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zwangsaggregiert zu haben. Inkubieren Sie die Platte dann bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid für die Bildung des Embryoidkörpers.

Nach 24 Stunden Inkubation wird die Platte in die Haube umgefüllt und 120 Mikroliter des Mediums vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt, wobei darauf zu achten ist, dass der Embryoidkörper nicht abgesaugt wird, indem die Pipettenspitze zu weit in die Vertiefung abgesenkt wird.

Geben Sie anschließend 150 Mikroliter frisches E6-Medium, ergänzt mit 2 mikromolaren XAV939 und den SMAD-Inhibitoren, in jede Vertiefung. Übertragen Sie die Platte zurück in den Inkubator und ersetzen Sie das Medium täglich durch frisch zubereitetes E6, ergänzt mit den Inhibitoren.

Prüfen Sie am siebten Tag der Inkubation, ob alle Embryoidkörper einen Durchmesser von 550 bis 600 Mikrometern erreicht haben und eine glatte, klare Kante aufweisen. In diesem Stadium sind sie bereit, in eine extrazelluläre Matrix eingebettet zu werden.

Um die Organoide einzubetten, bereiten Sie Noppen-Einbettungsfolien vor, indem Sie eine 4 Zoll lange thermoplastische Dichtungsfolie auf eine leere P200-Schachtel legen. Verwenden Sie dann ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen oder ein 500-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen und drücken Sie das Folienblatt vorsichtig in die Löcher, um 12 oder die gewünschte Anzahl von Grübchen herzustellen.

Sprühen Sie anschließend 70 % Ethanol auf die Folienfolie und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei eingeschaltetem UV-Licht in der Haube trocknen. In der Zwischenzeit wird eine ausreichende Menge der Basalmembranmatrix auf dem Eis aufgetaut. Übertragen Sie dann mit einer P200-Spitze mit breiter Bohrung einen Embryoidkörper von der 96-Well-Platte auf jedes Grübchen. Entfernen Sie so viel Medium wie möglich mit einer normalen Pipettenspitze, aber lassen Sie den Embryoidkörper nicht trocknen.

Geben Sie anschließend mit einer normalen vorgekühlten P200-Spitze etwa 30 Mikroliter unverdünnte Membranmatrix zu jedem Organoid und stellen Sie sicher, dass sich der Embryoidkörper so nah wie möglich am Zentrum des Tröpfchens befindet.

Sobald alle Embryoidkörper in die Matrix eingebettet sind, legen Sie das Filmblatt in eine sterile Petrischale. Dann inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid, damit sich die Membranmatrix verfestigen kann.

Für die Organoid-Differenzierung geben Sie 5 Milliliter des vorbereiteten Differenzierungsmediums mit B27 ohne Vitamin A in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit extrem geringer Anhaftung. Heizen Sie die Platte in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius vor. Sobald sich die Membranmatrix verfestigt hat, übertragen Sie die eingebetteten Embryoidkörper auf die 6-Well-Platte, indem Sie die Grübchen von der Rückseite der Filmfolie herausdrücken. Verwenden Sie bei Bedarf 1 Milliliter Medium aus der Vertiefung und pipettieren Sie es auf das Blatt, um die Tröpfchen vom Filmblatt zu lösen.