Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

Nehmen wir ein durchblutetes Rattengehirn. In kleine Stücke hacken.

Homogenisieren Sie das Gewebe in einem Puffer, um Zellen, einschließlich Mikroglia, freizusetzen.

Sobald sich das unverdaute Gewebe abgesetzt hat, sammeln Sie den Überstand mit den Zellen und fügen Sie einen Myelin-Trennpuffer hinzu.

Mischen Sie den Inhalt und zentrifugieren Sie, um die Zellen von Myelin und Ablagerungen zu trennen. Entfernen Sie die Myelin-Trümmer-Schicht und den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in Puffer und pipettieren Sie, um die Klumpen zu trennen.

Die Suspension wird durch ein Sieb geleitet, um verbleibende Zellaggregate zu entfernen.

Übertragen Sie die gefilterten Zellen auf eine Kulturplatte, die mit Mikroglia-spezifischen monoklonalen Antikörpern beschichtet ist. Inkubieren, um die Adhäsion der Mikroglia zu erleichtern.

Mit Puffer waschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Trypsin hinzufügen und inkubieren, um die Mikroglia zu lösen.

Entfernen Sie Trypsin.

Fügen Sie serumfreie Medien hinzu. Inkubieren Sie auf Eis, um die Wechselwirkungen zwischen Zellen und Substrat zu schwächen.

Pipettieren und die Suspension in einem Röhrchen auffangen. Zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie Mikroglia in serumfreien Medien und übertragen Sie sie auf eine kollagenbeschichtete Multiwell-Platte. Inkubieren, um die Adhäsion der Mikroglia zu erleichtern.

Fügen Sie Medien mit Wachstumsfaktoren und Lipiden hinzu. Inkubieren Sie für die Reifung der Mikroglia.

Nachdem die Gehirne in kaltem DPBS gesammelt wurden, hacken Sie jedes Gehirn in einer Petrischale auf Eis mit einer kalten Skalpellklinge in ein Kubikmillimeter große Stücke und geben Sie es in einen eiskalten Dounce-Homogenisator mit 5 bis 7 Millilitern eiskaltem Douncing-Puffer. Verwenden Sie anschließend einen locker sitzenden Dounce Homogenisator, um das Gewebe mit 10 bis 20 sanften und unvollständigen Hüben zu dissoziieren. Achten Sie darauf, das Gewebe am Boden des Homogenisators nicht direkt zu zerquetschen. Schieben Sie das Gewebe stattdessen durch den Raum zwischen den Seiten des Kolbens und des Homogenisators.

Es ist wichtig, das Gewebe mit mehreren Dounzierungsrunden langsam zu homogenisieren, um die Lebensfähigkeit der Mikroglia zu erhalten.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Kolben, um das Eindringen von Luftblasen zu verhindern. Lassen Sie schlecht dissoziierte Gewebestücke am Boden des Homogenisators absetzen und übertragen Sie den Überstand in ein neues, gekühltes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Ersetzen Sie anschließend das entfernte Volumen durch frischen Dounzierpuffer und wiederholen Sie den Dissoziationsvorgang für insgesamt drei bis vier Runden oder bis das gesamte Gewebe dissoziiert ist.

Bei diesem Verfahren wird dem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, das die Zellsuspension enthält, eiskalter Douncing-Puffer zugesetzt und das Gesamtvolumen auf 33,5 Milliliter eingestellt. Fügen Sie dann 10 Milliliter MSB zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Dies führt zu einer Endkonzentration von 23 % MSB in einem Volumen von 43,5 Millilitern.

Danach zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 500 g bei 4 Grad Celsius und bremsen langsam. Entfernen Sie dann die oberste Schicht aus Myelin und Schmutz sowie den Überstand mit einer Pipette. Achten Sie beim Entfernen der obersten Schicht darauf, dass so viel wie möglich davon entfernt wird.

Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in 12 Millilitern Panning-Puffer. Zerreiben Sie die Zellsuspension vorsichtig, um verbleibende Zellklumpen aufzubrechen. In diesem Schritt wird die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb geleitet, um große Ablagerungen oder Zellklumpen zu entfernen. Spülen Sie die mit OX42 beschichtete Panning Dish dreimal mit DPBS aus. Lassen Sie die Platte zwischen den Wäschen nicht vollständig trocknen.

Gießen Sie die letzte DPBS-Wäsche ab und tragen Sie die gefilterte Zellsuspension auf die Panning Dish auf. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte dann 20 Minuten lang auf einer ebenen Fläche bei Raumtemperatur, damit die Zellen haften können. Inkubieren Sie nicht länger als 20 Minuten, da es sonst sehr schwierig wird, sich von den Zellen aus der Schale zu erholen. Spülen Sie anschließend die Panning Dish 10 Mal mit DPBS aus, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.

Mikroglia werden fest mit der Platte verbunden, also schwenken Sie die Platte bei jedem Spülen, um sicherzustellen, dass andere nicht haftende Zellen entfernt werden. Gießen Sie die letzte DPBS-Wäsche ab und ersetzen Sie sie durch 15 Milliliter DPBS und 200 Mikroliter Trypsin.

Um die Zellen zu trypsinisieren, inkubieren Sie die Schale weniger als oder gleich 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach 10 Minuten Trypsinisierung kleben die Mikroglia immer noch an der Platte. Gießen Sie die Mischung ab und waschen Sie die Platte vorsichtig zweimal mit DPBS, um das Trypsin zu entfernen. Dann durch 12 Milliliter eiskaltes MGM ersetzen.

Stellen Sie die Panning Dish anschließend zwei Minuten lang auf Eis, um die Interaktion zwischen Zellen und Substrat zu schwächen, und stellen Sie sicher, dass die Schale flach ist, um zu verhindern, dass Bereiche der Panning Dish austrocknen. Pipettieren Sie danach kräftig mit einer 10-Milliliter-Pipette und einer Pipettensteuerung bei hoher Geschwindigkeit, um Zellen aus der Schwenkschale zu gewinnen. Zeichne ein 16 x 16 großes Gitter mit dem Flüssigkeitsstrahl aus der Pipette, um zu versuchen, alle Zellen zu entfernen.

Es ist wichtig, ein Gleichgewicht zwischen der allgemeinen Zellregeneration und der Gesundheit Ihrer Kultur zu finden. Wiederholtes Pipettieren eines Zellüberstands gegen die Panning-Schale führt zu einer verminderten Lebensfähigkeit Ihrer Kultur.

Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie sich von der Platte gelöst haben. Markieren Sie die Stellen auf der Oberseite der Schale, an denen Zellen festsitzen, und wiederholen Sie das Pipettieren in diesen Bereichen. Die Zellsuspension wird aufgefangen und 3 bis 4 Milliliter Überstand in jedem konischen 15-Milliliter-Röhrchen aliquotiert. Schleudern Sie ihn 15 Minuten lang bei 500 g bei 4 Grad Celsius und bremsen Sie langsam.

Nach 15 Minuten aspirieren Sie den Überstand und lassen 0,5 Milliliter MGM mit dem Zellpellet zurück. Suspendieren Sie dann jedes Pellet im restlichen MGM und poolen Sie die Zellen aus allen Röhrchen. Zählen Sie anschließend die Zellen mit dem Hämozytometer.

Platten Sie nun 15 Mikroliter Kollagen-IV-Beschichtung direkt in die Mitte einer anionischen, kationisch beschichteten 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt haben, verdünnen Sie sie auf 2,3 x ^10-5 pro Milliliter in MGM. Aspirieren Sie den Kollagen-IV-Spot und plättieren Sie sofort 15 Mikroliter Zellsuspension an dieser Stelle, um 3,5 x 10³ Zellen pro Spot zu erhalten.

Inkubieren Sie anschließend fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen haften können. Geben Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter CO₂ -äquilibriertes TIC in die Vertiefung.