Selektive Entnahme von Mikroglia aus einer Kleinhirn-Neuronenkultur der Ratte

Nimm ein geerntetes Kleinhirn der Ratte und hacke es in Fragmente.

Übertragen Sie die Fragmente in ein Röhrchen mit Trypsin und inkubieren Sie.

Trypsin verdaut die extrazelluläre Matrix des Gewebes und lockert die Kleinhirn-Körnerneuronen sowie nicht-neuronale Zellen wie Mikroglia und Astrozyten.

Fügen Sie einen Puffer hinzu, der einen Trypsin-Inhibitor und DNase enthält. Der Inhibitor inaktiviert Trypsin, während DNase kontaminierende DNA abbaut.

Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie das Gewebe in einem Puffer, der den Inhibitor und DNase enthält, und dissoziieren Sie es mechanisch, um eine Einzelzellsuspension zu bilden.

Überlagern Sie die Suspension mit einer proteinhaltigen Pufferlösung.

Zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Überstand mit Zelltrümmern.

Resuspendieren Sie die Zellen in Medien und säen Sie sie auf Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern, um die zelluläre Anheftung zu erleichtern.

Entfernen Sie das Medium. Waschen Sie die Zellen mit frischen Medien und fügen Sie dann Medien hinzu, die einen Zellzyklushemmer enthalten, um die Proliferation von Gliazellen zu verhindern.

Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frische Medien, die einen Lysosomeninhibitor enthalten.

Der Inhibitor zielt selektiv auf Mikroglia ab und zerstört lysosomale Membranen, was zum Absterben der Mikroglia und zur Entfernung aus der Kultur führt.

Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie das Kleinhirn von vier bis sieben Tage alten Rattenbabys sammeln. Legen Sie sie sofort in eine Petrischale mit fünf Millilitern Lösung A auf Eis. Entfernen Sie dann überschüssige Lösung aus dem Kleinhirn und legen Sie das Gewebe in den Deckel der Petrischale. Als nächstes hackst du das Taschentuch mit einer gut geflammten Rasierklinge in mindestens drei verschiedene Richtungen fein.

Sie anschließend das gehackte Taschentuch zu Lösung B. Legen Sie es fünf Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es alle paar Minuten vorsichtig. Geben Sie dann 20 Milliliter Lösung D in das Röhrchen, um das Trypsin zu neutralisieren. Schütteln und bei 65 g fünf Minuten zentrifugieren. Gießen Sie anschließend den Überstand ab. Resuspendieren Sie es in vier Millilitern Lösung C.

Die Probe wird mit jeder der drei Pipetten aus geflammtem Glas mit abnehmendem Durchmesser 10 Mal zertriert, bis die Suspension so homogen wie möglich ist. Geben Sie dann langsam und vorsichtig einige Tropfen dieses Homogenats auf das BSA-EBSS. Wenn es anfängt, durch das BSA-EBSS zu sinken, zerreiben Sie mehr und fügen Sie etwas mehr Lösung C hinzu. Das Homogenat sollte in einer Schicht auf dem BSA-EBSS liegen.

Bei 100 g drehen und nicht schütteln. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter MEM-Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und plattieren Sie sie mit 800.000 Zellen pro Deckglas in 500 Mikrolitern MEM-Medium. Legen Sie sie danach in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 6 % Kohlendioxid. Stellen Sie dann eine Lösung aus MEM-Medium her, die 10 Mikromolare des Zellzyklushemmers AraC enthält.

Für jedes Deckglas werden 250 Mikroliter des alten Mediums in einer frischen 24-Well-Platte aufbewahrt und der Rest abgesaugt. Fügen Sie 250 Mikroliter normales MEM-Medium hinzu, um die Zellen zu waschen. Geben Sie anschließend 250 Mikroliter altes Medium zurück in die Zellen und füllen Sie es mit 250 Mikrolitern AraC-haltigem Medium auf.

Bei diesem Verfahren wird reines LME zu fünf Millilitern MEM-Medium gegeben, um eine Endkonzentration von 150 Millimolar LME zu erhalten. Bringen Sie die Lösung mit einer Säure-Base-Lösung wieder auf pH 7,4. Anschließend wird es mit einem 28-Millimeter-PES mit 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter sterilfiltriert.

Anschließend verdünnen Sie die LME-Lösung auf eine Konzentration von 50 Millimolar in MEM-Medium. Legen Sie es dann für 10 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, zusammen mit normalem MEM-Medium für Kontrollkulturen. Entfernen Sie nach 10 Minuten 250 Mikroliter des MEM-Mediums aus jeder CGC-Kultur. Halten Sie das Medium dann bei 37 Grad Celsius.

Anschließend werden die Zellen mit MEM-Medium behandelt, das das Doppelte von LME enthält, oder mit vorgewärmtem MEM-Medium ohne LME für Kontrollkulturen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6 % Kohlendioxid für eine Stunde. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal in frischem, vorgewärmtem MEM-Medium, um das LME-haltige Medium zu entfernen.

Ersetzen Sie dann das zurückgehaltene Nährmedium durch die gleiche Menge frisches, vorgewärmtes MEM-Medium. Zum Schluss inkubieren Sie die Kulturen in 6 % befeuchtetem Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.