DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen DNA-Fingerabdruck von Mycobacterium lere, dem nicht kultivierbaren Bakterium, das Lepra verursacht, direkt aus klinischen Proben zu entwickeln. M lri bakterielle DNA, die aus Patientenbiopsien extrahiert wird, wird durch eine Multiplex-PCR unter Verwendung von Fluoreszenzprimern amplifiziert, die spezifisch für die variable Anzahl Tandem Repeat oder VNTR-Loci sind. Sobald die DNA amplifiziert wurde, wird eine Kapillarelektrophorese zur Analyse der Fragmentlänge durchgeführt.

Die Daten werden analysiert, um die Anzahl der kurzen Tandem-Repeat-DNA-Segmente an jedem Locus zu bestimmen. Denn verschiedene Stämme von EPRI weisen an jedem Locus eine unterschiedliche Anzahl von Tandem-Wiederholungen auf. Daten von mehreren Loci erzeugen einzigartige DNA-Fingerabdrücke und eine Datenbank mit den Stammtypen des Patienten kann mit dieser Technik erstellt werden.

Die Populationsstruktur, die Evolution und die Übertragung von Lepra zwischen Patienten in definierten Gemeinschaften und auf der ganzen Welt können charakterisiert werden, was letztendlich genetische Werkzeuge und Beweise für die Eliminierung von Lepra liefert. Diese Methode kann verwendet werden, um die Ausbreitung von Lepra zu verfolgen, Cluster von kürzlichen Infektionen und Risikopersonen zu identifizieren und die Wirksamkeit kontrollierter Programme zu messen. Wir werden das Verfahren von Lee und Ron Jensen, Forschern aus meinem Labor, und Jason Rivers von unserer Instrument Core Facility Extract, DNA aus klinischen Biopsien mit einem Standard-KaiGen-DNA-Extraktionskit demonstrieren.

Sobald die DNA gewonnen wurde, richten Sie einen neuen Arbeitsbereich in einem sauberen PCR-Schrank ein. Um eine DNA-Kontamination zu vermeiden, wischen Sie den Schrank und einen Satz Pipetten mit 70 % Ethanol ab und setzen Sie den Schrank und die Pipetten 15 Minuten lang UV-Licht aus. Sobald der Schrank sauber ist, kann die Multiplex-PCR für jede Multiplex-PCR mit vier bis fünf Primerpaaren eingerichtet werden, wobei ein Primer pro Paar fluoreszenzmarkiert ist.

Muss gemischt werden. Verwenden Sie 10 mikromolare Primer, die in einem Puffer vorbereitet sind, um die Primermischungen herzustellen. Mischen Sie gleiche Mengen aller vorderen oder oberen Primer in einem Einor-Röhrchen, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren zu erreichen. Für jede Grundierung bei Bedarf TE-Puffer hinzufügen.

In einem anderen oder anderen Primer werden alle umgekehrten oder unteren Grundierungen auf die gleiche Weise gemischt. Sobald die Primermischungen hergestellt sind, bereiten Sie die PCR-MES-Mischung vor. Erstellen Sie eine Tafelkarte, die mit allen Stichproben und Kontrollen pro Probe beschriftet ist.

Der Mastermix sollte 12 Mikroliter KaiGen Multiplex-PCR-Mix, zwei Mikroliter jedes Primerpools und zwei Mikroliter Q-Lösung enthalten. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Master-Mix erstellen, um Kontrollen einzuschließen und Pipettierverluste zu berücksichtigen. Den Mastermix kurz zentrifugieren.

Als nächstes aliquotieren Sie 18 Mikroliter Mastermix in jede Vertiefung einer PCR-Platte. Um eine Kontamination der DNA-Proben zu vermeiden, wechseln Sie die Handschuhe, wischen Sie eine separate Biosicherheitswerkbank ab und desinfizieren Sie sie. Sobald die Haube dekontaminiert wurde, übertragen Sie die Platte wie zuvor auf diese Haube.

Geben Sie dann zwei Mikroliter DNA-Probe in jede Vertiefung mit dem Mastermix. Achten Sie darauf, Pipettenspitzen zur Aerosolprävention zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verschließen Sie die PCR-Platten vorsichtig und zentrifieren Sie kurz, um den Inhalt zu vermischen.

Legen Sie dann die Reaktionsplatte in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm zum Einsenden von Proben. Bereiten Sie für FLA die Formamidgröße vor, mischen Sie den Mastermix und geben Sie verdünnte PCR-Produkte in ein sauberes Einor-Röhrchen, kombiniert 12 Mikroliter Lösung mit hohem Dfor-Gehalt und 0,3 Mikroliter Genscan, 500 Deckelgrößenstandard pro zu testender Probe. Aliquotieren Sie 12,3 Mikroliter dieser Lösung pro Vertiefung in eine 96-Well-Reaktionsplatte mit optischer Qualität.

Sobald die PCR abgeschlossen ist, wird die Platte zentrifugiert. Stellen Sie sicher, dass die Position jeder Probe auf der Plattenkarte aufgezeichnet ist. Aliquotieren Sie dann in einer separaten 96-Well-Platte 59 Mikroliter nukleasefreies Wasser pro Well und fügen Sie einen Mikroliter jeder PCR-Reaktion pro Well hinzu, um die amplifizierte DNA bei eins bis 60 zu verdünnen.

Sobald die DNA verdünnt wurde, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um einen Mikroliter jeder verdünnten PCR-Probe in die entsprechende Vertiefung der Platte zu überführen, die die lose Formamidlösung enthält. Sobald das Programm abgeschlossen ist, können die Proben mit der Standard-Agros-Gelelektrophorese getestet werden, um zu bestätigen, dass die DNA-Fragmente der vorhergesagten Größen zu diesem Zeitpunkt amplifiziert wurden. Die Proben werden vor der Analyse durch Fluoreszenzkapillarelektrophorese mit einem FLA-Genanalysator für die Analyse vorbereitet, ein Septum in die Platte gegeben und kurz zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen und die Probe in die Vertiefung zu schlagen.

Thefor IDE denaturiert die Stränge chemisch, so dass keine Hitzedenaturierung erforderlich ist. Legen Sie die Platte in eine Ladeschale. Bewerten Sie das markierte PCR-Produkt mit Hilfe von Kapillarelektrophorese, wie z. B. dem genetischen Analysator 31 30 xl von ABBI.

Analysieren Sie die Proben mit einer 50 Zentimeter großen Kapillare, die mit Pop Seven Polymer als Trennmedium gefüllt ist. Die DNA wandert zum Ende der Kapillare, wo ein Laser und ein Detektor die Fluoreszenzmarkierungen messen und die Sammelsoftware des Analysators öffnen. Der Analysator muss kalibriert werden, um alle verwendeten Farbstoffe vor der Durchführung der Proben zu erkennen, einschließlich des Größenstandards, der für diese Proben verwendet wird, ist ABIs G Fünf Dissektproben werden 15 Sekunden lang bei 1,6 Kilovolt elektrokinetisch injiziert.

Trennen Sie die Fragmente, indem Sie 1800 Sekunden lang 15 Kilovolt anlegen. Die Gesamtlaufzeit für jeden Lauf beträgt ca. 45 Minuten. Erstellen Sie nach Abschluss der Ausführung Datendateien für jedes Beispiel.

Die Dateien werden von der Entnahmesoftware des Analysators in einem Plattenordner an einem vorher festgelegten Ort abgelegt. Die Dateien liegen im FSA-Format vor. FLA-Daten können mit Hilfe einer Peak-Scanner-Software analysiert werden, die auf der Website von Applied Biosystems frei verfügbar ist.

Um Daten zu analysieren, klicken Sie auf Neues Projekt starten und dann auf Dateien hinzufügen. Laden Sie die ausgewählten Datendateien in das Programm, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Wählen Sie die geladenen Dateien aus und analysieren Sie sie.

Die Ergebnisse werden als FLA-Chromatogramm dargestellt. Die Größenstandards erscheinen als orangefarbene Peaks, während die farbigen Peaks die bakteriellen DNA-Bewerber für jeden in der Probe analysierten Locus darstellen. Klicken Sie auf einen Peak, um die Größe des Basenpaares zu bestimmen. Aufgrund der DNA-Polymerase-Gleitstrangsynthese wird für einige Mikrosatelliten-Loci eine Familie von Peaks der gleichen Farbe detektiert.

In diesen Fällen ist der ausgewählte Peak in der Regel der Peak mit der größten Amplitude. Vergleichen Sie die Fragmentgrößen in jeder Probe mit der Positivkontrollgröße, um zu bestimmen, wie viele Tandem-Wiederholungssegmente für jedes getestete Ale l vorhanden sind, und notieren Sie die Daten zur weiteren Analyse in einer Excel-Tabelle. In dieser Abbildung ist der DNA-Fingerabdruck von Isolaten von sieben Patienten dargestellt, die zu drei verschiedenen Familien aus demselben Dorf gehören, und die Anzahl der Tandemwiederholungen für jeden analysierten polymorphen Locus ist angegeben.

Diese Daten deuten darauf hin, dass zwei Mitglieder der Familie mit demselben Stamm infiziert sind, während ein Mitglied mit einem bestimmten Stamm infiziert ist. Mitglieder der Familie C sind wahrscheinlich mit demselben Stamm infiziert. Ebenso wie die Mitglieder der Familie A.Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie routinemäßig Multiplex-PCR und Fragmentlängenanalyse einbeziehen, um V-N-T-R-D-N-A-Fingerabdrücke für Leprapatienten zu erhalten, die sich in Kliniken vorstellen.

Dabei handelt es sich um neuartige molekulare Werkzeuge, die die konventionelle Epidemiologie zur Bekämpfung von Lepraerkrankungen ergänzen.