DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen charakteristischen DNA-Fingerabdruck von Mycobacterium leprae, dem nicht kultivierbaren Bakterium, das Lepra verursacht, direkt aus klinischen Proben zu erstellen. Die aus Patientenbiopsien gewonnene M. leprae-Bakterien-DNA wird mittels einer Multiplex-PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern, die spezifisch für die Loci mit variabler Anzahl an Tandemwiederholungen (VNTR) sind, amplifiziert. Nach der DNA-Amplifikation erfolgt eine Kapillarelektrophorese zur Analyse der Fragmentlängen.

Die Daten werden analysiert, um die Anzahl der kurzen tandemwiederholten DNA-Abschnitte an jedem Locus zu bestimmen. Da verschiedene Stämme von EPRI unterschiedliche Anzahlen von Tandemwiederholungen an jedem Locus aufweisen, ergeben Daten aus mehreren Loci eindeutige DNA-Fingerabdrücke, und mithilfe dieser Technik kann eine Datenbank der Stammtypen von Patienten erstellt werden.

Die Populationsstruktur, Evolution und Übertragung der Lepra zwischen Patienten in definierten Gemeinschaften und weltweit kann charakterisiert werden, was letztendlich genetische Werkzeuge und Belege für die Ausrottung der Lepra liefert. Diese Methode kann verwendet werden, um die Ausbreitung der Lepra nachzuvollziehen, um Cluster aktueller Infektionen und gefährdete Individuen zu identifizieren sowie die Wirksamkeit kontrollierter Programme zu messen. Die Demonstration des Verfahrens übernehmen Lee und Ron Jensen, Forscher aus meinem Labor, sowie Jason Rivers aus unserer instrumentellen Kernfacility. Extrahieren Sie DNA aus klinischen Biopsien mithilfe eines standardmäßigen KaiGen-DNA-Extraktionskits.

Nachdem die DNA gewonnen wurde, bereiten Sie einen neuen Arbeitsbereich in einem sauberen PCR-Schrank vor. Um DNA-Kontaminationen zu vermeiden, desinfizieren Sie den Schrank und einen Satz Pipetten mit 70 % Ethanol und behandeln Sie diese sowie den Schrank 15 Minuten lang mit UV-Licht. Sobald der Schrank sauber ist, kann die Multiplex-PCR eingerichtet werden, wobei pro Multiplex-PCR vier bis fünf Primerpaare verwendet werden, von denen jeweils ein Primer pro Paar fluoreszenzmarkiert ist.

Muss gemischt werden. Verwenden Sie 10 Mikromolar-Primer-Stammlösungen, die in TE-Puffer hergestellt wurden, um die Primer-Mischungen anzusetzen; geben Sie gleiche Mengen aller Vorwärts- oder oberen Primer in ein Eppendorf-Röhrchen, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolar zu erreichen. Fügen Sie für jeden Primer gegebenenfalls TE-Puffer hinzu.

In einem weiteren Eppendorf-Gefäß mischen Sie alle reversen oder unteren Primer auf die gleiche Weise. Sobald die Primer-Mischungen hergestellt sind, bereiten Sie die PCR-MES-Mischung vor. Erstellen Sie eine Plattenkarte, die mit allen Proben und Kontrollen pro Probe beschriftet ist.

Die Master-Mischung sollte 12 Mikroliter KaiGen-Multiplex-PCR-Mix, zwei Mikroliter jeder Primer-Pool-Mischung und zwei Mikroliter Q-Lösung enthalten. Stellen Sie sicher, dass Sie eine ausreichende Menge an Master-Mischung ansetzen, um Kontrollen sowie Verluste durch Pipettieren zu berücksichtigen. Zentrifugieren Sie die Master-Mischung kurz.

Geben Sie als Nächstes 18 Mikroliter der Master-Mix-Lösung in jedes Loch einer PCR-Platte. Um eine Kontamination der DNA-Proben zu vermeiden, wechseln Sie die Handschuhe, wischen Sie einen separaten Sicherheitswerkbank ab und desinfizieren Sie diese. Wie zuvor übertragen Sie die Platte nach der Dekontamination des Gehäuses in diesen Abzug.

Fügen Sie dann zwei Mikroliter DNA-Probe in jede Vertiefung mit Mastermix hinzu. Verwenden Sie unbedingt Aerosol-Verhinderungs-Pipettenspitzen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Versiegeln Sie die PCR-Platten vorsichtig und zentrifugieren Sie sie kurz, um die Inhalte zu vermischen.

Danach die Reaktionsplatte in den Thermocycler geben und das PCR-Programm zum Einreichen von Proben starten. Für FLA das Formamid-Größenstandard, Mastermix vorbereiten und verdünnte PCR-Produkte in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen geben, kombiniert 12 Mikroliter hochgradige Formamidlösung und 0,3 Mikroliter GeneScan, 500 LID-Größenstandard pro zu testende Probe. Davon 12,3 Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Loch-Reaktionsplatte von optischer Qualität abpipettieren.

Nach Abschluss der PCR wird die Platte zentrifugiert. Achten Sie darauf, dass die Position jeder Probe auf der Plattenkarte vermerkt ist. Anschließend pipettieren Sie in eine separate 96-Well-Platte je 59 Mikroliter nukleasefreies Wasser pro Well und geben je ein Mikroliter jeder PCR-Reaktion pro Well hinzu, um die amplifizierte DNA im Verhältnis 1:60 zu verdünnen.

Nachdem die DNA verdünnt wurde, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ein Mikroliter jeder verdünnten PCR-Probe in das entsprechende Loch der Platte mit der Formamidlösung zu überführen. Sobald das Programm abgeschlossen ist, können die Proben mittels standardmäßiger Agarose-Gelelektrophorese daraufhin überprüft werden, ob DNA-Fragmente der vorhergesagten Größen zu diesem Zeitpunkt amplifiziert wurden. Die Proben werden zur Analyse mittels fluoreszenter Kapillarelektrophorese unter Verwendung eines FLA-Genanalysators vorbereitet; vor der Analyse wird ein Septum auf die Platte aufgesetzt und kurz zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen und die Probe in das Loch zu befördern.

Die IDE wird die Stränge chemisch denaturieren, sodass keine Hitzedenaturierung erforderlich ist. Stellen Sie die Platte in ein Ladegefäß. Werten Sie das markierte PCR-Produkt mittels Kapillarelektrophorese aus, beispielsweise mit dem genetischen Analysator ABBI'S 31 30 xl.

Analysieren Sie die Proben mithilfe eines 50 cm langen Kapillars, das mit dem Polymer Pop7 als Trennmedium gefüllt ist. Die DNA wandert zum Ende der Kapillare, wo ein Laser und ein Detektor die fluoreszierenden Markierungen messen. Öffnen Sie die Sammelsoftware des Analysegeräts. Das Gerät muss kalibriert werden, um alle vor dem Laufen der Proben verwendeten Farbstoffe zu detektieren, einschließlich des Größenstandards. Der für diese Proben verwendete Größenstandard ist ABIs G5. Die Proben werden elektrokinetisch bei 1,6 Kilovolt für 15 Sekunden injiziert.

Trennen Sie die Fragmente durch Anlegen von 15 Kilovolt für 1800 Sekunden. Die Gesamtlaufzeit pro Durchlauf beträgt etwa 45 Minuten. Erstellen Sie nach Beendigung des Durchlaufs Datendateien für jede Probe.

Die Dateien werden von der Sammelsoftware des Analysegeräts in einem vorbestimmten Speicherort in einem Plattenordner abgelegt. Die Dateien liegen im FSA-Format vor. FLA-Daten können mit der Peak-Scanner-Software analysiert werden, die kostenlos auf der Website von Applied Biosystems verfügbar ist.

Um die Daten zu analysieren, klicken Sie auf „Neues Projekt starten“ und anschließend auf „Dateien hinzufügen“. Laden Sie die ausgewählten Datendateien in das Programm, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Wählen Sie die geladenen Dateien aus und analysieren Sie sie.

Die Ergebnisse werden als FLA-Chromatogramm dargestellt. Die Größenstandards erscheinen als orangefarbene Peaks, während die farbigen Peaks die bakteriellen DNA-Proben für jeden im Probe analysierten Locus darstellen. Klicken Sie auf einen Peak, um dessen Basenpaargröße zu bestimmen. Aufgrund der Slipp-Strang-Synthese durch die DNA-Polymerase wird für einige Mikrosatelliten-Loci eine Peak-Familie gleicher Farbe nachgewiesen.

In diesen Fällen wird normalerweise der Peak mit der größten Amplitude ausgewählt. Vergleichen Sie die Fragmentgrößen in jeder Probe mit der Größe der positiven Kontrolle, um festzustellen, wie viele tandem wiederholte Segmente für jedes getestete Allel vorhanden sind, und tragen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle für weitere Analysen ein. In dieser Abbildung sind die DNA-Fingerabdrücke von Isolaten aus sieben Patienten dargestellt, die drei verschiedenen Familien desselben Dorfes angehören, und die Anzahl der tandem Wiederholungen für jeden analysierten polymorphen Locus ist angegeben.

Diese Daten deuten darauf hin, dass zwei Mitglieder der Familie B mit demselben Stamm infiziert sind, während ein Mitglied mit einem unterschiedlichen Stamm infiziert ist. Mitglieder der Familien C sind wahrscheinlich mit demselben Stamm infiziert. Gleiches gilt für Mitglieder der Familie A. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man routinemäßig multiplex-PCR und Fragmentlängenanalyse einsetzt, um V-N-T-R-D-N-A-Fingerabdrücke von Lepra-Patienten zu erhalten, die in Kliniken vorgestellt werden.

Dies sind neuartige molekulare Werkzeuge, die die konventionelle Epidemiologie zur Kontrolle der Lepra-Erkrankung ergänzen.