Name: DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie die DNA-Fingerabdruckanalyse von Mycobacterium leprae mittels VNTR-Typisierung und Fragmentlängenanalyse. Diese Methode ermöglicht die Nachverfolgung von Lepra-Übertragungen und die Identifizierung von Infektionsclustern für gezielte Gesundheitsinterventionen.

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Die Finanzierung wurde durch die NIH / NIAID gewähren RO1-AI-63457 und ARRA gewähren ergänzen RO1-AI-63457 S1 zur Verfügung gestellt. Wir erkennen die Beiträge aller aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Labors Gruppe und Mitarbeiter.

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Die Sammlung von Hautproben von Lepra-Patienten erfordert qualifizierte Ärzte oder Techniker arbeiten an Hautkliniken. Labormitarbeiter Umgang mit diesen Proben müssen mit großer Sorgfalt zu Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen zu tragen und in einem Bio-Sicherheitsschrank Arbeit beim Umgang mit infizierten Proben menschlichen oder Gürteltier Gewebe. Desinfektion von Oberflächen und Tools ist ebenfalls entscheidend. Arbeiten in einem sauberen, sterilen biologisch sichere Schrank ist zur Vermeidung von Kontamination von DNA-Proben wichtig. DNA-Extraktion hat sich relativ einfach durch die Entwicklung der Extraktion Kits von Firmen wie Qiagen. Anfahrt müssen unbedingt beachtet werden. Alle Proben sollten kühl gehalten werden, wenn nicht in Gebrauch ist. Vermeiden Sie wiederholte, extreme Temperaturschwankungen für die Proben. DNA-Primer in dieser Arbeit verwendet werden kann aus verschiedenen Unternehmen, die in der Liste der Literaturangaben wurden am Ende dieses Beitrags zitiert bestellt werden. Es ist darauf zu mit Primern in einem DNA-freien Umgebung zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Primer kommen als trockenes Pulver und muss mit TE gemischt und verdünnt, um eine 100 &amp;mgr; Konzentration, dann in kleineren Mengen (Abbildung 2a) getrennt. Working-Lösungen von Primer sind weiter auf 10 um Konzentrationen verdünnt. Auch hier verwenden Sie keine DNA-Proben in den Bereichen / Hauben wo Primer verwendet und sind bereit. PCR-Produkte sollten auch gehalten, wenn nicht in Gebrauch ist kalt. Eine 3% Agarosegel Vorbereitung wird eine bessere DNA-Bande Trennung, dauert aber länger zu laufen. Für rein qualitative Zwecke, 2% in der Regel ausreichend. Ethidiumbromidlösung zur Färbung der DNA in Agarosegelen verwendet ist ein hochaktiver genotoxische Wirkung, die durch die Haut absorbiert wird. Handle dieser Lösung und Gele mit ihm mit großer Sorgfalt und stets sicher, dass das Tragen von Handschuhen gefärbt. Waschen Sie Ihre Hände nach dem Umgang mit allen DNA-Proben oder Ethidiumbromid Materialien. Entsorgen Ethidiumbromidfärbung Lösung, waschen und Gele nach den Richtlinien des Instituts. Gele werden nicht routinemäßig erforderlich, kann dieser Schritt entfallen, sobald FLA-Methoden festgelegt wurden. Es ist Zeit und Reagenzien verbraucht. Die Formamidlösung in Vorbereitung der Proben für die FLA verwendet wird, auch sehr giftig und sollte mit Sorgfalt behandelt werden. Waschen Sie Ihre Hände nach dem Gebrauch. Entsorgen Sie folgende Richtlinien des Instituts. Beim Lesen der Ergebnisse der FLA mit Peak-Scanner-Software kann eine Herausforderung sein. Eine Reihe grundlegender Allel Anrufe (Anzahl der Tandem-Repeats) hat der CSU (Tabellen 4-7) entwickelt worden. (Anzumerken ist, dass Tabellen 4-7 nicht all inclusive sein. Wie auch andere Stämme von M. leprae studiert werden, Allele mit Kopie Zahlen außerhalb der Bereiche aufgeführt gefunden werden kann.) Eine besondere Herausforderung besteht darin, &#39;stottern&#39; Gipfel. Dies sind Familien von Gipfeln, vor allem von Verdachtsanzeigen, die nur um 2-3 Basenpaare wiederholt, wie (TA) 10. Manchmal Auswahl der richtigen Höhepunkt zu lesen ist schwierig (Abbildung 7). In dieser Abbildung ist der Höhepunkt in der positiven Kontrolle bei 190 bp der Hauptpeak. Peaks geringer Höhe, die 2 sind, 4 oder sogar 6 Basenpaare größer oder kleiner als der Hauptgipfel heißen &quot;stottern Gipfel.&quot; A-Tailing kann auch zu Verwechslungen führen. A-Tailing ist bereits im Text und in Abbildung 8 beschrieben. Schließlich, wenn PCR-Produkte sehr häufig in den Proben sind, kann Peaks mit einer Doppel-Spitze erscheinen. In diesem Fall lesen Sie die Mitte des Peaks zu bilden. (Siehe Abbildung 6, Patient 6). Datenmanagement kann eine gewaltige Aufgabe für diese Art von Arbeit sein. Es ist wichtig, alle relevanten Informationen für alle Experimente wie Rekord: Datum einer Aufgabe oder eines Verfahrens, Betreiber, Streifen / Platte Karten, FLA Bestellungen, PCR-Bedingungen und Rezepte, Termine von Gelen und Fotografien, Lagertemperaturen, DNA-Template Verdünnungen, FLA elektronische Datei Lagerorte, etc. Eine gute Organisation und Datenverwaltung, kann Ihnen Stunden Zeit damit verbracht, auf der Suche nach spezifischen Informationen in die Zukunft. Das Labor hier beschriebenen Arbeiten hat schon seit mehreren Jahren an der Colorado State University und an anderen Orten auf der ganzen Welt. Das große Bild von dem, was all der gesammelten Daten bedeutet und wie es bezüglich der künftigen Nutzung ist im Entstehen begriffen. 10A und 10B zeigen, wie diese DNA-Fingerprints verwendet werden, um verschiedene M. zu unterscheiden leprae Stämme zwischen den Ländern (10A) oder auch zwischen Familien (10B). Familie und Gemeinschaft verbunden Fällen hat sich gezeigt, M. tragen leprae von ähnlichen oder identischen VNTR Belastung Typen. Die Hoffnung ist, dass es möglich sein, weitere Einblicke in die Wirkungsweise (n) der Lepra Übertragung zu gewinnen, so dass eine Früherkennung von Übertragungsnetzen für jene Leute mos entwickelt werden könnent in Gefahr, und das heilende medikamentöse Therapie beginnen kann, bevor bleibende neurologische und dermatologische Schaden entsteht.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> DNeasy Blood and Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA-Primer </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose Gel </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x oder 6x Gel-Ladepuffer </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Rezepte zur Verfügung, um Ihre eigenen * machen </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid-Lösung </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Verdünnen von con. </td></tr><tr><td> Hallo-Di Formamidlösung </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene Scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Ausstattung </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 2 Kühlschränke </td><td> 4 ° C: 1 für die DNA-Proben, 1 für Grundierungen und Multiplex-Reagenzien </td></tr><tr><td> 1 Mikrowellenherd </td><td> Oder geeigneter Weise für Heizung und Wasser Agarose Gele machen </td></tr><tr><td> 1-Autoklaven </td><td> Oder Dampfkochtopf für die Sterilisation Materialien </td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td> Thermocycler </td></tr><tr><td> 2 Sätze von Pipetten </td><td> 0,5-10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, 1000 ul 1 Satz für Primer, 1 Satz für DNA </td></tr><tr><td> Submarine Gelelektrophorese box </td><td> Mit Formen und Kämme für Herstellung von Gelen. </td></tr><tr><td> Elektrophorese-Netzteil </td><td> Mit Kabel für den Anschluss an Gel-Box </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Für Eppendorf-Röhrchen </td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Für Eppendorf-Röhrchen / Streifen </td></tr><tr><td> Kapillarelektrophorese-System (Genetic Analyzer) </td><td> Oder um eine Institution, die diese Analyse durchzuführen zugreifen können </td></tr><tr><td> Plastics </td><td> Einweg-Aerosol-Pipettenspitzen, Eppendorf-Röhrchen, 8-Well-Streifen, 96-Well-Platten, einige optische Qualität </td></tr><tr><td> Computer mit Internet-Anschluss </td><td></td></tr></tbody></table>

dna fingerprinting von mycobacterium leprae die stämme mit variablen anzahl tandem repeat (vntr) - fragment length analysis (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Das Studium der Übertragung von Lepra ist besonders schwierig, da der Erreger, Mycobacterium leprae, kann nicht im Labor kultiviert werden. Die einzige Quelle für die Bakterien sind Lepra-Patienten und experimentell infizierten Gürteltiere und Nacktmäuse. So sind viele der Methoden in der modernen Epidemiologie verwendet werden, nicht für das Studium der Lepra zur Verfügung. Trotz einer umfangreichen weltweiten medikamentösen Behandlung Programm für die Lepra durch die WHO 1 implementiert, bleibt Lepra endemisch in vielen Ländern mit rund 250.000 Neuerkrankungen pro Jahr. 2 Die gesamte M. leprae Genom wurde 3,4 abgebildet und viele Loci identifiziert worden, die haben Segmenten von 2 oder mehr Basenpaare wiederholt (so genannte Mikro-und Minisatelliten). 5 Klinische Stämme von M. leprae kann in der Anzahl der Tandem wiederholte Segmente (short tandem repeats, STR) auf vielen dieser Loci variieren. 5,6,7 Variable Anzahl Tandem-Repeat (VNTR) 5 Analyse verwendet wurde, um verschiedene Stämme des Lepra-Bazillen zu unterscheiden. Einige der loci scheinen stabiler zu sein als andere, zeigen weniger Schwankungen in wiederholen Zahlen, während andere sich schneller ändern, manchmal in den gleichen Patienten zu sein scheinen. Während die Variabilität bestimmter VNTRs hat Fragen hinsichtlich ihrer Eignung für Stammtypisierung 7,8,9 brachte, legen die Schwellenländer Daten, die Analyse mehrerer Loci, die vielfältig in ihrer Stabilität sind, können als wertvolle epidemiologische Instrument verwendet werden. Multiple locus VNTR-Analyse (MLVA) 10 wurde verwendet, um die Lepra Entwicklung und Übertragung in mehreren Ländern, darunter China 11,12, Malawi 8, auf den Philippinen 10,13 und Brasilien 14 studierst. MLVA umfasst mehrere Schritte. Erstens ist die bakterielle DNA zusammen mit Wirtsgewebe DNA aus klinischen Biopsien oder Schlitz Haut schmiert (SSS) extrahiert. 10 Die gewünschte loci dann aus der extrahierten DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Fluoreszenzmarkierten Primer für 4-5 verschiedene Loci pro Reaktion eingesetzt, mit 18 Loci in insgesamt vier Reaktionen verstärkt. 10 Die PCR-Produkte auf Agarose-Gelelektrophorese unterworfen werden können, um das Vorhandensein des gewünschten DNA-Abschnitte zu überprüfen, und dann eingereicht für Leuchtstofflampen-Fragment-Längen-Analyse (FLA) mittels Kapillarelektrophorese. DNA aus Gürteltier passagiert Bakterien mit einer bekannten Anzahl von wiederholten Kopien für jeden Locus wird als positive Kontrolle verwendet. Die FLA-Chromatogramme werden dann unter Verwendung Peak-Scanner-Software-und Fragment-Länge ist auf die Anzahl der VNTR Kopien (Allel) umgewandelt. Schließlich werden die VNTR Haplotypen nach Mustern analysiert und, wenn sie mit Patienten klinische Daten kombiniert werden verwendet, um Verteilung der Belastung Arten zu verfolgen.

Lepra, verursacht durch<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Ist immer noch in vielen Orten endemisch. Um über die Verbreitung und Art der Übertragung der Lepra zu lernen, ist es wichtig zu ermitteln, welche Belastung der<em&gt; M. leprae</em&gt; Hat ein Patient infiziert. Variable Anzahl von Tandem Repeats (VNTR-Typisierung) ist eine solche Methode.

DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Die Untersuchung der Übertragung von Lepra ist besonders schwierig, da der Erreger, Mycobacterium leprae, im Labor nicht kultiviert werden kann.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen charakteristischen DNA-Fingerabdruck von Mycobacterium leprae, dem nicht kultivierbaren Bakterium, das Lepra verursacht, direkt aus klinischen Proben zu erstellen. Die aus Patientenbiopsien gewonnene M. leprae-Bakterien-DNA wird mittels einer Multiplex-PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern, die spezifisch für die Loci mit variabler Anzahl an Tandemwiederholungen (VNTR) sind, amplifiziert. Nach der DNA-Amplifikation erfolgt eine Kapillarelektrophorese zur Analyse der Fragmentlängen. Die Daten werden analysiert, um die Anzahl der kurzen tandemwiederholten DNA-Abschnitte an jedem Locus zu bestimmen. Da verschiedene Stämme von EPRI unterschiedliche Anzahlen von Tandemwiederholungen an jedem Locus aufweisen, ergeben Daten aus mehreren Loci eindeutige DNA-Fingerabdrücke, und mithilfe dieser Technik kann eine Datenbank der Stammtypen von Patienten erstellt werden.Die Populationsstruktur, Evolution und Übertragung der Lepra zwischen Patienten in definierten Gemeinschaften und weltweit kann charakterisiert werden, was letztendlich genetische Werkzeuge und Belege für die Ausrottung der Lepra liefert. Diese Methode kann verwendet werden, um die Ausbreitung der Lepra nachzuvollziehen, um Cluster aktueller Infektionen und gefährdete Individuen zu identifizieren sowie die Wirksamkeit kontrollierter Programme zu messen. Die Demonstration des Verfahrens übernehmen Lee und Ron Jensen, Forscher aus meinem Labor, sowie Jason Rivers aus unserer instrumentellen Kernfacility. Extrahieren Sie DNA aus klinischen Biopsien mithilfe eines standardmäßigen KaiGen-DNA-Extraktionskits.Nachdem die DNA gewonnen wurde, bereiten Sie einen neuen Arbeitsbereich in einem sauberen PCR-Schrank vor. Um DNA-Kontaminationen zu vermeiden, desinfizieren Sie den Schrank und einen Satz Pipetten mit 70 % Ethanol und behandeln Sie diese sowie den Schrank 15 Minuten lang mit UV-Licht. Sobald der Schrank sauber ist, kann die Multiplex-PCR eingerichtet werden, wobei pro Multiplex-PCR vier bis fünf Primerpaare verwendet werden, von denen jeweils ein Primer pro Paar fluoreszenzmarkiert ist.Muss gemischt werden. Verwenden Sie 10 Mikromolar-Primer-Stammlösungen, die in TE-Puffer hergestellt wurden, um die Primer-Mischungen anzusetzen; geben Sie gleiche Mengen aller Vorwärts- oder oberen Primer in ein Eppendorf-Röhrchen, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolar zu erreichen. Fügen Sie für jeden Primer gegebenenfalls TE-Puffer hinzu.In einem weiteren Eppendorf-Gefäß mischen Sie alle reversen oder unteren Primer auf die gleiche Weise. Sobald die Primer-Mischungen hergestellt sind, bereiten Sie die PCR-MES-Mischung vor. Erstellen Sie eine Plattenkarte, die mit allen Proben und Kontrollen pro Probe beschriftet ist.Die Master-Mischung sollte 12 Mikroliter KaiGen-Multiplex-PCR-Mix, zwei Mikroliter jeder Primer-Pool-Mischung und zwei Mikroliter Q-Lösung enthalten. Stellen Sie sicher, dass Sie eine ausreichende Menge an Master-Mischung ansetzen, um Kontrollen sowie Verluste durch Pipettieren zu berücksichtigen. Zentrifugieren Sie die Master-Mischung kurz. Geben Sie als Nächstes 18 Mikroliter der Master-Mix-Lösung in jedes Loch einer PCR-Platte. Um eine Kontamination der DNA-Proben zu vermeiden, wechseln Sie die Handschuhe, wischen Sie einen separaten Sicherheitswerkbank ab und desinfizieren Sie diese. Wie zuvor übertragen Sie die Platte nach der Dekontamination des Gehäuses in diesen Abzug.Fügen Sie dann zwei Mikroliter DNA-Probe in jede Vertiefung mit Mastermix hinzu. Verwenden Sie unbedingt Aerosol-Verhinderungs-Pipettenspitzen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Versiegeln Sie die PCR-Platten vorsichtig und zentrifugieren Sie sie kurz, um die Inhalte zu vermischen. Danach die Reaktionsplatte in den Thermocycler geben und das PCR-Programm zum Einreichen von Proben starten. Für FLA das Formamid-Größenstandard, Mastermix vorbereiten und verdünnte PCR-Produkte in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen geben, kombiniert 12 Mikroliter hochgradige Formamidlösung und 0,3 Mikroliter GeneScan, 500 LID-Größenstandard pro zu testende Probe. Davon 12,3 Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Loch-Reaktionsplatte von optischer Qualität abpipettieren.Nach Abschluss der PCR wird die Platte zentrifugiert. Achten Sie darauf, dass die Position jeder Probe auf der Plattenkarte vermerkt ist. Anschließend pipettieren Sie in eine separate 96-Well-Platte je 59 Mikroliter nukleasefreies Wasser pro Well und geben je ein Mikroliter jeder PCR-Reaktion pro Well hinzu, um die amplifizierte DNA im Verhältnis 1:60 zu verdünnen.Nachdem die DNA verdünnt wurde, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ein Mikroliter jeder verdünnten PCR-Probe in das entsprechende Loch der Platte mit der Formamidlösung zu überführen. Sobald das Programm abgeschlossen ist, können die Proben mittels standardmäßiger Agarose-Gelelektrophorese daraufhin überprüft werden, ob DNA-Fragmente der vorhergesagten Größen zu diesem Zeitpunkt amplifiziert wurden. Die Proben werden zur Analyse mittels fluoreszenter Kapillarelektrophorese unter Verwendung eines FLA-Genanalysators vorbereitet; vor der Analyse wird ein Septum auf die Platte aufgesetzt und kurz zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen und die Probe in das Loch zu befördern.Die IDE wird die Stränge chemisch denaturieren, sodass keine Hitzedenaturierung erforderlich ist. Stellen Sie die Platte in ein Ladegefäß. Werten Sie das markierte PCR-Produkt mittels Kapillarelektrophorese aus, beispielsweise mit dem genetischen Analysator ABBI'S 31 30 xl.Analysieren Sie die Proben mithilfe eines 50 cm langen Kapillars, das mit dem Polymer Pop7 als Trennmedium gefüllt ist. Die DNA wandert zum Ende der Kapillare, wo ein Laser und ein Detektor die fluoreszierenden Markierungen messen. Öffnen Sie die Sammelsoftware des Analysegeräts. Das Gerät muss kalibriert werden, um alle vor dem Laufen der Proben verwendeten Farbstoffe zu detektieren, einschließlich des Größenstandards. Der für diese Proben verwendete Größenstandard ist ABIs G5. Die Proben werden elektrokinetisch bei 1,6 Kilovolt für 15 Sekunden injiziert.Trennen Sie die Fragmente durch Anlegen von 15 Kilovolt für 1800 Sekunden. Die Gesamtlaufzeit pro Durchlauf beträgt etwa 45 Minuten. Erstellen Sie nach Beendigung des Durchlaufs Datendateien für jede Probe.Die Dateien werden von der Sammelsoftware des Analysegeräts in einem vorbestimmten Speicherort in einem Plattenordner abgelegt. Die Dateien liegen im FSA-Format vor. FLA-Daten können mit der Peak-Scanner-Software analysiert werden, die kostenlos auf der Website von Applied Biosystems verfügbar ist.Um die Daten zu analysieren, klicken Sie auf „Neues Projekt starten“ und anschließend auf „Dateien hinzufügen“. Laden Sie die ausgewählten Datendateien in das Programm, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Wählen Sie die geladenen Dateien aus und analysieren Sie sie.Die Ergebnisse werden als FLA-Chromatogramm dargestellt. Die Größenstandards erscheinen als orangefarbene Peaks, während die farbigen Peaks die bakteriellen DNA-Proben für jeden im Probe analysierten Locus darstellen. Klicken Sie auf einen Peak, um dessen Basenpaargröße zu bestimmen. Aufgrund der Slipp-Strang-Synthese durch die DNA-Polymerase wird für einige Mikrosatelliten-Loci eine Peak-Familie gleicher Farbe nachgewiesen.In diesen F&auml;llen wird normalerweise der Peak mit der gr&ouml;&szlig;ten Amplitude ausgew&auml;hlt. Vergleichen Sie die Fragmentgr&ouml;&szlig;en in jeder Probe mit der Gr&ouml;&szlig;e der positiven Kontrolle, um festzustellen, wie viele tandem wiederholte Segmente f&uuml;r jedes getestete Allel vorhanden sind, und tragen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle f&uuml;r weitere Analysen ein. In dieser Abbildung sind die DNA-Fingerabdr&uuml;cke von Isolaten aus sieben Patienten dargestellt, die drei verschiedenen Familien desselben Dorfes angeh&ouml;ren, und die Anzahl der tandem Wiederholungen f&uuml;r jeden analysierten polymorphen Locus ist angegeben.Diese Daten deuten darauf hin, dass zwei Mitglieder der Familie B mit demselben Stamm infiziert sind, während ein Mitglied mit einem unterschiedlichen Stamm infiziert ist. Mitglieder der Familien C sind wahrscheinlich mit demselben Stamm infiziert. Gleiches gilt für Mitglieder der Familie A. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man routinemäßig multiplex-PCR und Fragmentlängenanalyse einsetzt, um V-N-T-R-D-N-A-Fingerabdrücke von Lepra-Patienten zu erhalten, die in Kliniken vorgestellt werden.Dies sind neuartige molekulare Werkzeuge, die die konventionelle Epidemiologie zur Kontrolle der Lepra-Erkrankung ergänzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren ein nicht-invasives Vorgehen bei der Probennahme, um effizient zu sammeln Haarproben von schwer fassbaren kleinen Säugetieren, wie für den amerikanischen pika gezeigt. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode durch Extraktion von DNA aus Proben Haar und verstärkt verschiedene Arten von molekularen Markern häufig in Studien für Wildtierkunde und Ökologie und Naturschutz eingesetzt.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Quelle: Gulla, S., et al. Multi-Locus-Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels multiplexer PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Trennung fluoreszierend markierter variabler Tandem-Repeat-(VNTR)-Amplicons, die von einem fischpathogenen Bakterium abgeleitet sind, mithilfe kapillarer Elektrophorese zur Erstellung größenspezifischer Elektropherogrammprofile zur Bakterienidentifikation.

Nachweis von Fischpathogenen mittels Variable Number Tandem Repeat (VNTR)-Analyse

Ein Verstärkungsmikroarray kombiniert asymmetrischen PCR-Amplifikation und Mikroarray-Hybridisierung in einer einzigen Kammer, die Mikroarray-Arbeitsprozess deutlich vereinfacht für den Endbenutzer. Vereinfachung der Microarray-Workflow ist ein notwendiger erster Schritt für die Erstellung von Microarray-basierte Diagnostik, die routinemäßig in der unteren-Ressource-Umgebungen eingesetzt werden kann.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Wir berichten über ein prägnantes Verfahren der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in der Gonade und den Embryonen von Caenorhabditis elegans zur Beobachtung und Quantifizierung repetitiver Sequenzen.  Wir haben erfolgreich zwei verschiedene repetitive Sequenzen beobachtet und quantifiziert, Telomerwiederholungen und Template der alternativen Verlängerung von Telomeren (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Eine verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP-Verfahren zur Genotypisierung Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie beschrieben. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith Säule wird zur Trennung verdaut Amplikons eingesetzt. Dieses Verfahren kann die monoisotopisch Massen von Oligonukleotiden aufzuklären, die zur Identifizierung Basenzusammensetzung nützlich ist.

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragmentanalyse diskutiert, die eine schnelle und effiziente direkte Messung der Telomerlänge ermöglicht. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zellquellen von DNA zur Quantifizierung der Telomerlänge angewendet werden.

Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

Der hier vorgestellte Multi-Locus Variable-number Tandem-Repeat Analysis (MLVA)-Assay ermöglicht eine kostengünstige, robuste und tragbare hochauflösende Genotypisierung des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri. Ausgehend von reinen Kulturen verwendet der Assay Multiplex-PCR- und Kapillarelektrophorese, um zehn Loci MLVA-Profile für nachgelagerte Anwendungen zu erstellen.

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analyse des Fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri durch Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Erstellung von DNA-Fingerabdruckprofilen durch Amplifizierung des VNTR-Locus D1S80 aus Epithelzell-DNA.

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Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

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In dieser Studie wurde eine Dot-Blot-Anwendung entwickelt, um Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung minimaler DNA-Mengen, die spezifisch auf eine Digoxigenin-markierte Sonde abzielen und von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper leicht nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für Screening-Zwecke.

Polymerase-Kettenreaktion und Dot-Blot-Hybridisierung zum Nachweis von Leptospiren in Wasserproben

Erfahren Sie die DNA-Fingerabdruckanalyse von Mycobacterium leprae mittels VNTR-Typisierung und Fragmentlängenanalyse. Diese Methode ermöglicht die Nachverfolgung von Lepra-Übertragungen und die Identifizierung von Infektionsclustern für gezielte Gesundheitsinterventionen.

DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA) (Video) | JoVE Journal

DNA Fingerprinting von Mycobacterium leprae Die Stämme mit variablen Anzahl Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

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