Entwicklung von humanen iPSC-abgeleiteten motorischen Nervenorganoiden mit einem mikrofluidischen Chip

Nehmen Sie humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) in einem nährstoffreichen Stammzellmedium mit Rho-Kinase-Inhibitoren.

Die Inhibitoren dringen in die Zellen ein und blockieren die Rho-Kinase-Enzyme, wodurch der apoptotische Zelltod verhindert wird.

Die Zellen nutzen die Nährstoffe, um sich zu vermehren und spontan zu einem dreidimensionalen Zellcluster zu aggregieren, der als Sphäroid bezeichnet wird.

Ersetzen Sie das Medium nach und nach durch ein neuronales Induktionsmedium. Signalmodulatoren aus dem Medium treiben die Differenzierung von Stammzellen zu Nervenzellen voran.

Ersetzen Sie es durch ein wachstumsfaktorreiches neuronales Medium, um die Sphäroidzellen in Motoneuronen zu differenzieren und ein Motoneuron-Sphäroid oder MNS zu bilden.

Übertragen Sie diese MNS auf einen polymerbeschichteten mikrofluidischen Chip, der ein Reifungsmedium enthält.

Die Nervenwachstumsfaktoren im Medium regen die Axone oder längeren Fortsätze von Neuronen an, vom Sphäroid aus zu wachsen und sich durch den Mikrokanal des Chips zu erstrecken.

Dabei entsteht ein motorisches Nervenorganoid, ein dreidimensionales Modell des motorischen Nervengewebes.

Um die Differenzierung von 3D-iPS-Zellen in Motoneuronen zu induzieren, säen Sie 4 x 10⁴ iPS-Zellen pro Vertiefung in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte in 100 Mikrolitern Feeder- und serumfreiem Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y27632

Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter KSR-Medium, das mit 10 mikromolaren SB-431542 und 100 nanomolaren LDN-193189 ergänzt wird. Ersetzen Sie an den Tagen 2 und 3 die Überstände durch 100 Mikroliter KSR-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB-431542, 100 nanomolaren LDN-193189, 5 mikromolaren DAPT, 5 mikromolaren SU-5402, 1 mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten. An den Tagen 4 und 5 ersetzen Sie die Überstände durch eine Mischung aus 75 % KSR-Medium und 25 % N2-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SP-431542, 100 nanomolaren LDN-193189, 5 mikromolaren DAPT, 5 mikromolaren SU-5402, 1 mikromolaren Retinsäure und 1 mikromolar geglätteten Agonisten.

Ersetzen Sie an den Tagen 6 und 7 die Überstände durch eine Mischung aus 50 % KSR-Medium und 50 % N2-Medium, ergänzt mit 5 mikromolaren DAPT, 5 mikromolaren SU-5402, 1 mikromolaren Retinsäure und 1 mikromolar geglätteten Agonisten. Ersetzen Sie an den Tagen 8 und 9 die Überstände durch eine Mischung aus 25 % KSR-Medium und 75 % N2-Medium, ergänzt mit 5 mikromolaren DAPT, 5 mikromolaren SU-5402, 1 mikromolaren Retinsäure und 1 mikromolar geglätteten Agonisten. Ersetzen Sie an den Tagen 10 und 11 die Überstände durch N2-Medium, das mit 5 mikromolaren DAPT, 5 mikromolaren SU-5402, 1 mikromolaren Retinsäure und 1 mikromolaren geglätteten Agonisten ergänzt wird. Ersetzen Sie an Tag 12 die Überstände in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter Reifungsmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophen Faktor aus dem Gehirn pro Vertiefung.

Um die Bildung von motorischen Nervenorganoiden zu induzieren, ersetzen Sie die Beschichtungslösung im PDMS-Chip durch 150 Mikroliter Reifungsmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors, und verwenden Sie eine Mikropipettenspitze mit breiter Bohrung, um Motoneuronen-Sphäroide vorsichtig aus einer Vertiefung der 96-Well-Platte in den Einlass des Mikrokanals des Chips hinzuzufügen. Stellen Sie ein kleines Reservoir mit sterilem Wasser in die Nähe des Gewebekulturchips in die Schale, um eine Verdunstung des Mediums zu verhindern, und stellen Sie die Schale in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des erschöpften Nährmediums aus der Mitte des Mediumreservoirs durch frisches Reifungsmedium, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophen Faktors aus dem Gehirn ergänzt wird. Axone wachsen vom Sphäroid des Motoneurons in den Kanal hinein und fügen sich über einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen spontan zu einem einzigen Bündel zusammen, um ein motorisches Nervenorganoid zu bilden.