Erzeugung einer neuronalen Kultur mit extrem niedriger Dichte unter Verwendung einer neuronalen Feederschicht mit hoher Dichte

Beginnen Sie mit zwei Multi-Well-Platten: eine mit einem geätzten Boden, der mit einem Polymer beschichtet ist, und die andere mit einem polymerbeschichteten Deckglas.

Säen Sie eine Suspension der embryonalen Neuronen mit hoher Dichte in die Platte mit dem geätzten Boden ein. Fügen Sie dem Deckglas eine Neuronensuspension mit extrem niedriger Dichte hinzu.

Inkubieren, um die neuronale Bindung an die Polymere zu ermöglichen.

Entfernen Sie das Deckglas und legen Sie es über die Neuronenkultur mit hoher Dichte, so dass sich die Neuronen gegenüberstehen können.

Die geätzte Oberfläche mit erhabenen Strukturen schafft einen Mikroraum, der Neuronen unterschiedlicher Dichte trennt.

Die Kultur mit hoher Dichte fungiert als Feeder-Schicht und sezerniert den neuronalen Wachstumsfaktor.

Aufgrund des begrenzten Diffusionsraums sammeln sich die Wachstumsfaktoren um die Neuronen herum an, was ihr Wachstum und die Entwicklung neuronaler Projektionen erleichtert.

Einführung eines neurobasalen Mediums mit Cytosin-Arabinosid, das selektiv das Wachstum der nicht-neuronalen Zellen hemmt.

Füllen Sie regelmäßig mit einem frischen neurobasalen Medium auf, um die neuronale Kultur zu erhalten.

Platzieren Sie bei diesem Verfahren 24-Well-Platten mit geätztem Boden für Neuronen mit hoher Dichte in der Kulturhaube. Entfernen Sie 300 Mikroliter des vorkonditionierten Mediums durch Vakuum. Dann plattieren Sie 0,6 Milliliter Zellsuspension mit hoher Dichte bei 250.000 Neuronen pro Milliliter.

Legen Sie die anderen 224-Well-Platten mit Deckgläsern in die Kulturhaube. Entfernen Sie 300 Mikroliter des vorkonditionierten Mediums durch Vakuum, bevor Sie 0,6 Milliliter Zellsuspension mit niedriger Dichte bei 10.000 Neuronen pro Milliliter auf die Deckgläser aufbringen. Geben Sie anschließend alle 24-Well-Platten wieder in den Inkubator zurück und inkubieren Sie zwei Stunden lang. Drehen Sie danach die Deckgläser mit niedriger Dichte mit den anhaftenden Neuronen in die Kultur mit hoher Dichte um und stellen Sie sicher, dass die Neuronen einander zugewandt sind. Anschließend stellen Sie die beiden Platten mit Cokultur wieder in den Inkubator ein.

Füttern Sie die Co-Kulturen mit 300 Mikrolitern frischem Futtermedium bei DIV 5. Nach dieser Erstfütterung geben Sie jede Woche 300 Mikroliter frisches Futtermedium ohne Cytosin-Arabinosid in jede Vertiefung. Sollte die Kultur länger als einen Monat gelagert werden, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums jede Woche durch frisches Futtermedium, über einen Zeitraum von einem Monat hinaus.