Differenzierung von induzierten neuralen Vorläuferzellen in Astrozyten

Nehmen Sie eine Kultur von induzierten neuralen Vorläuferzellen (iNPCs) auf einer mit extrazellulären Matrixproteinen beschichteten Multi-Well-Platte.

Ersetzen Sie das Medium durch gliale Induktionsmedien und inkubieren Sie. Wachstumsfaktoren und Hormone in den Medien erleichtern die Differenzierung von iNPCs in gliale Vorläuferzellen.

Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für die Zellproliferation. Ersetzen Sie dann das Medium durch Astrozytenmedien und inkubieren Sie.

Spezifische Nährstoffe und Wachstumsfaktoren in den Medien treiben die Differenzierung der glialen Vorläuferzellen zu Astrozyten voran.

Medienwechsel jeden zweiten Tag fördern die Reifung der Astrozyten.

Wechseln Sie das Medium auf Neuro-Diff-Medium, wenn die Zellen zu etwa 70 % konfluent sind, und wechseln Sie das Medium drei Wochen lang jeden zweiten Tag. Teilen Sie die Zellen während der Differenzierung nicht. Nach drei Wochen sollten die Zellen den neuronalen Marker TuJ1 exprimieren.

Um reifere Neuronen und neuronale Subtypen zu gewinnen, setzen Sie die Differenzierung bis zu drei Monate fort. Für die Differenzierung von iNPCs spezifisch in Richtung einer glialen Abstammungslinie wechseln Sie das Medium zu glialem Induktionsmedium, einschließlich 20 Nanogramm pro Milliliter epidermalem Wachstumsfaktor, um die Differenzierung in gliale Vorläuferzellen zu induzieren. Entfernen Sie die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es etwa zwei Wochen lang jeden zweiten Tag durch frisches Medium.

Während dieser Zeit sollten die Zellen in Gegenwart von 10 mikromolaren Rho-Kinase-Inhibitoren in 1 bis 3 geteilt werden, wenn eine Konfluenz von 100 % erreicht ist. Nach zwei Wochen differenzieren Sie die Zellen weiter in Astrozyten, indem Sie das Medium auf das kommerziell erhältliche Astrozytenmedium umstellen, wenn die Zellen nahezu zusammenfließen, und indem Sie das Medium weiterhin jeden zweiten Tag wechseln. Etwa sieben Tage später beginnen die Zellen, Astrozytenmarker zu exprimieren.