Initiierung einer schnellen Neuritenverlängerung und -bildung Funktionelle neuronale Verbindungen

Beginnen Sie mit dem Zusammenbau eines mikrofluidischen Geräts mit Mikrokanälen in einer mit Lysin beschichteten Schale.

Säen Sie embryonale Neuronen mit einem Wachstumsmedium in die mikrofluidischen Vertiefungen, so dass sie durch die Mikrokanäle fließen können.

Inkubieren, um die Anheftung und das Wachstum von Neuronen zu erleichtern und physisch isolierte neuronale Populationen zu bilden.

Zerlegen Sie das Setup und stellen Sie die Schale in eine Mikromanipulatorkammer mit Kochsalzlösung, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Führen Sie mit Lysin beschichtete Kügelchen in die Nähe der Neuronen ein, so dass sich die Neuriten oder Zellprojektionen anheften und Kügelchen-Neuriten-Komplexe bilden können.

Wenden Sie mit einem Mikromanipulator einen Sog an, um einen Kügelchen-Neuriten-Komplex aus einem Kanal zu aktivieren.

Ziehen Sie an diesem Komplex, um mechanische Spannung zu induzieren, was zu einer schnellen Neuritenausdehnung führt.

Leiten Sie diesen zu einem anderen Kügelchen-Neuronen-Komplex und halten Sie ihn mit einem zweiten Mikromanipulator.

Halten Sie beide Kügelchen an Ort und Stelle, um die Bildung einer neuritischen Verbindung zu erleichtern.

Lassen Sie den Sog los und ersetzen Sie die Kochsalzlösung durch ein Nährmedium.

Inkubieren, um funktionelle Verbindungen zwischen Neuronen herzustellen und die Kommunikation durch Neurotransmitter zu fördern.

Entfernen Sie das Medium aus den oberen Vertiefungen der mikrofluidischen Geräte, ohne die Vertiefungen zu entleeren. Geben Sie dann 20 Mikroliter der konzentrierten Zelllösung in die obere rechte Vertiefung des mikrofluidischen Geräts und überprüfen Sie im Mikroskop, wie die Zellen in dem mikrofluidischen Gerät für eine einzelne Population fließen.

Um Zellen in der Vorrichtung für mehrere Populationen zu plattieren, geben Sie 20 Mikroliter der konzentrierten Zelllösung in jede der oberen Vertiefungen. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen in den Kammern befinden. Legen Sie die Geräte anschließend für 15 bis 30 Minuten in den Inkubator, um die Zellanhaftung an das Substrat zu fördern.

Nachdem sich die Zellen an das Substrat anheften, geben Sie 40 Mikroliter NBM in die beiden oberen Vertiefungen des Geräts für eine einzelne Population. Dies hilft, die Luftblasen aus den Mikrokanälen zu entfernen. Geben Sie 20 Mikroliter NBM in die oberen Vertiefungen des Geräts für mehrere Populationen, die gleichen Vertiefungen, in die die Zellen injiziert wurden. Das Medium sollte leicht hervorstehen, um einen positiven Meniskus zu bilden und den Vertiefungen ein muffinoberes Aussehen zu verleihen.

Ein bis zwei Tage vor der Entnahme der mikrofluidischen Geräte geben Sie 2 Milliliter vorgewärmtes NBM in jede Probenschale und fluten Sie die Kammern. Bewahren Sie die Geräte dann im Inkubator auf. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pinzette und eine Pipettenspitze, um die mikrofluidischen Geräte von den Deckgläsern zu entfernen, so dass eine gemusterte Konfiguration der Neuronen zurückbleibt.

Geben Sie bei diesem Verfahren 40 bis 60 Mikroliter der vorbereiteten PDL-beschichteten Kügelchen in die Zellkultur. Geben Sie die Probe dann für eine Stunde in den Inkubator zurück, um die Bildung von synaptischen Kontakten zu fördern. Anschließend installieren Sie die Probe in einem Versuchsaufbau so, dass die Zellen von oben mit zwei Mikropipetten beurteilt und auch optisch zugänglich sind. In dieser Konfiguration befindet sich eine CCD-Kamera an der Seitenöffnung des Mikroskops für die Bildaufnahme. Verbinden Sie jede mit Kochsalzlösung gefüllte Pipette mit einer 1-Milliliter-Spritze. Anschließend wird die Probe mit physiologischer Kochsalzlösung durchblutet.

Überprüfen Sie als Nächstes unter dem Mikroskop die Lücke zwischen den beiden isolierten neuronalen Populationen, um sicherzustellen, dass die beiden Populationen nicht auf natürliche Weise miteinander verbunden sind. Wählen Sie im Sichtfeld eine PDL-Perle aus, die nicht an das Neuron gebunden ist. Richten Sie die Perle mit einer Mikropipettenspitze aus, indem Sie sich auf die Perle und dann auf die Mikropipette konzentrieren.

Bringen Sie anschließend die Spitze so nah wie möglich an die Perle, indem Sie sie durch das Mikroskop überwachen. Üben Sie dann Unterdruck auf die Pipette aus, um die Perle aufzunehmen, und halten Sie den Unterdruck während des gesamten Experiments aufrecht.

Wählen Sie nun eine PDL-Perle aus, die an einem Neuron im Sichtfeld befestigt ist, und befestigen Sie sie durch Saugen an der zweiten Mikropipette. Ziehen Sie den PDL-Kügelchen-Neuron-Komplex, indem Sie entweder den Mikromanipulator oder den Probentisch langsam mit 0,5 Mikrometern pro Minute für 1 Mikrometer bewegen und fünf Minuten lang pausieren, um die Neuriteninitiierung zu ermöglichen.

Ziehen Sie den PDL-Kügelchen-Neuron-Komplex, indem Sie ihn langsam seitlich mit 0,5 Mikrometern pro Minute über 2 Mikrometer bewegen. Machen Sie dann eine Pause von fünf Minuten, um eine Neuritendehnung zu ermöglichen. Nach erfolgreicher Initiierung und Neuritenverlängerung für die ersten 5 Mikrometer ziehen Sie den Neurit kontinuierlich mit 20 Mikrometern pro Minute.

Um die Neuronen zu verbinden, wählen Sie eine Region aus, die reich an Neuriten ist. Verwenden Sie andere Kügelchen, um die Höhe der Pipettenspitze über dem Deckglas zu messen, und senken Sie den PDL-Kügelchen-Neuriten-Komplex so ab, dass er physisch mit den Neuriten in Kontakt kommt. Lassen Sie den PDL-Kügelchen-Neuriten-Komplex in Kontakt mit dem Zielneurit, während Sie die zweite Mikropipette manipulieren. Senken Sie dann die zweite Pipette mit der zweiten PDL-Kugel etwa 20 Mikrometer von der ersten Kugel entfernt auf den neu gebildeten Neurit ab und schieben Sie mit der zweiten PDL-Kugel das neue Neuritenfilament in Richtung der Zielzelle.

Halten Sie dann beide Perlen mindestens eine Stunde lang an Ort und Stelle. Vergewissern Sie sich, dass es keine fokale Schwellung gibt, d. h. eine Verdickung der Neuriten, die mit dem Mikroskop mit der Perle in Kontakt kommen. Während dieser Zeit wird das Medium der Probe langsam von physiologischer Kochsalzlösung auf vorgewärmtes Kohlendioxid-äquilibriertes NBM umgestellt.

Lösen Sie die Perle von der zweiten Pipette, indem Sie den Sog loslassen. Wenn der neue Neurit angehängt bleibt, lassen Sie auch die erste Geschwindigkeit los. Legen Sie die Probe anschließend vorsichtig zurück in den Inkubator, um die neuronale Verbindung für zukünftige Experimente zu stärken.