Aufreinigung von CD31⁺ endothelialen Vorläuferzellen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Nehmen Sie eine adhärente Kultur von endothelialen Vorläuferzellen oder EPCs, Vorläufern von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns.

Die Kultur, die durch Differenzierung pluripotenter Stammzellen gewonnen wurde, besteht aus EPCs, die für den Oberflächenmarker CD31 positiv sind, und kontaminierenden CD31-negativen Zellen.

Inkubieren Sie mit einem Dissoziationsreagenz, um die Zellen abzulösen, und filtern Sie, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Fügen Sie ein Medium hinzu, um die Enzyme zu neutralisieren, zentrifugieren Sie, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie die Zellen in einem Puffer.

Inkubieren Sie mit einem blockierenden Reagenz, um die zellulären Fc-Rezeptoren zu hemmen und eine unspezifische Markierung zu verhindern.

Fügen Sie einen Fluorophor-konjugierten Antikörper hinzu, der spezifisch für CD31 ist, und inkubieren Sie, um die EPCs zu markieren.

Zentrifugieren und ungebundene Antikörper verwerfen. Inkubieren Sie mit Antikörperkomplexen, die einen Antikörper enthalten, der an die Fluorophore bindet.

Sie polymerbeschichtete magnetische Nanopartikel ein und inkubieren Sie, so dass die Nanopartikel an den zweiten Antikörper des Komplexes binden können.

die nanopartikelgebundenen Zellen mit Hilfe eines Magnetfeldes.

Verwerfen Sie die Suspension mit unmarkierten CD31-negativen Zellen und resuspendieren Sie die gereinigten Zellen in einem Medium. Die CD31-positiven EPCs sind bereit für nachgelagerte Assays.

Am Tag 5 der Kultivierung der endothelialen Vorläuferzellen aspirieren Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie 1 Milliliter Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 6 bis 8 Minuten bei 37 Grad Celsius. Dissoziieren und vereinzeln Sie die Zellen mit einer Mikropipette und leiten Sie dann die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern DMEM/F-12-Medium zu filtrieren.

Um die Aufschlussreaktion zu stoppen, geben Sie DMEM/F-12/10 10 medium bis zur 50-Milliliter-Marke zu. Pipettieren Sie gründlich und reservieren Sie 10 Mikroliter für die Zählung der Zellen. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 200 g für 5 Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Küvettenpellet mit 10 Millilitern DMEM/F-12/10 Medium resuspendiert.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 200 g für fünf Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius, um die Zellen wieder zu pelletieren. Suspendieren Sie dann das Zellpellet wieder in den Durchflusspuffer 1. Als nächstes fügen Sie das FcR-Blockierungsreagenz im Verhältnis 1 zu 100 hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang. Fügen Sie dann das verdünnte Fluoresceinisothiocyanat mit einem Verhältnis von 1 zu 200 oder den FITC-markierten CD31-Antikörper hinzu.

Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen 20 und 25 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation fügen Sie der Probe 10 Milliliter Flusspuffer 1 hinzu und reservieren Sie 10 Mikroliter der Suspension für die Durchflusszytometrie-Analyse, um den Anteil der CD31-positiven Zellen zu bestimmen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 g für 5 Minuten bei 20 bis 25 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden die Zellen mit der Lösung des Flusspuffers 1 resuspendiert.

Als nächstes fügen Sie 5 Mikroliter des FITC-Auswahlcocktails pro 100 Mikroliter der Zellsuspension hinzu. Mischen Sie die Lösung gründlich durch Pipettieren und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen 20 und 25 Grad Celsius. Fügen Sie als nächstes 5 Mikroliter magnetische Nanopartikel pro 100 Mikroliter Zellsuspension hinzu. Pipettieren Sie die Mischung gut und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang im Dunkeln bei 20 bis 25 Grad Celsius.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5-Milliliter-Durchflusszytometrieröhrchen und fügen Sie Flusspuffer 1 hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2,5 Millilitern zu erhalten. Legen Sie dann das Durchflusszytometrie-Röhrchen für fünf Minuten in den Magneten. Drehen Sie den Magneten in einer kontinuierlichen Bewegung um und dekantieren Sie die Zellsuspension, die unmarkierte FITC-CD31-Antikörperzellen enthält. Halten Sie den Magneten und das Rohr 2 bis 3 Sekunden lang in der umgekehrten Position und entfernen Sie dann die restliche Flüssigkeit.

Saugen Sie alle Tröpfchen am Rand des Schlauchs an, bevor Sie den Schlauch wieder in eine aufrechte Position bringen. Nehmen Sie das Durchflusszytometrie-Röhrchen aus dem Magneten und fügen Sie 2,5 Milliliter Durchflusspuffer 1 hinzu, um die verbleibenden CD31-positiven Zellen zu waschen. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig zwei- oder dreimal auf und ab, um sie wieder zu suspendieren. Setzen Sie dann den Durchflussschlauch für fünf Minuten in den Magneten ein.

Wiederholen Sie das Waschen mindestens viermal, um die unmarkierten FITC-CD31-Zellen aus dem Röhrchen zu entfernen. Entfernen Sie das Durchflussrohr vom Magneten und resuspendieren Sie die gereinigten CD31-positiven Zellen mit der gewünschten Menge eines geeigneten Mediums. Reservieren Sie zwei 1-Mikroliter-Aliquots der Suspension, eines für die Zellzählung und das zweite für die Durchführung einer Durchflusszytometrie-Analyse zur Beurteilung der Reinheit von CD31-positiven Zellen in postmagnetisch aktivierten Zellsortierproben.