Mikrofabrizierten Post-Array-Detektoren (mPADs): Ein Ansatz zur Mechanical Forces Isolate

Hallo, ich bin Nathan Snia Decky, und heute begleiten mich Wes Ligan, Robbie Desai und Mike Yang. Wir stammen aus dem Labor von Chris Chen an der University of Pennsylvania. In diesem Video stellen wir unseren Ansatz zur Messung zellulärer Anziehungskräfte mithilfe eines mikrofabrizierten Pfostenarrays vor.

Zugkräfte entstehen durch Wechselwirkungen zwischen Myosin und Aktin und spielen eine wichtige Rolle in unserer Physiologie. Während der Entwicklung ermöglichen sie es Zellen, sich von einem Ort zum nächsten zu bewegen, um die frühen Strukturen unseres Gewebes zu bilden. Außerdem unterstützen sie den Heilungsprozess, da sie für die Schließung von Wunden sowie für die Migration und das Kriechen von Leukozyten durch unseren Körper notwendig sind.

Doch leider können dieselben Kräfte für unsere Gesundheit schädlich sein, wie beispielsweise beim Krebsmetastasieren oder beim Wachstum von Blutgefäßen in Richtung eines Tumors. Daher gibt es nur sehr wenige Methoden, mit denen man diese Zugkräfte tatsächlich quantitativ messen kann, insbesondere im Mikro- und Nanometerbereich einzelner Zellen. Die meisten gängigen Methoden zur Untersuchung von Zellen in vitro verwenden Schalen mit Glasboden oder aus Polystyrol, doch diese Substrate sind sehr starr und ermöglichen es uns nicht, die von einer Zelle verursachten Zugkräfte und Deformationen physisch zu messen.

Es war daher sehr schwierig, die zugrundeliegenden Mechanismen von Zugkräften zu verstehen, ohne eine Art physikalische Messung. In Chris Chens Labor verfügen wir über eine Technik, die es uns ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden. Unsere Methode basiert auf einem vertikalen Array flexibler Konsolen, deren Steifigkeit und Größenordnung so beschaffen sind, dass einzelne Zellen über mehrere Konsolen hinweg ausbreiten und diese dabei verformen.

Die Abmessungen, die wir am häufigsten verwenden, sind zylindrische Säulen mit einem Durchmesser von drei Mikrometern und einer Höhe von 10 Mikrometern, mit einem Zentrum-zu-Zentrum-Abstand von neun Mikrometern in rechteckiger Anordnung. Diese Abmessungen können jedoch variiert werden, um eine Vielzahl zellulärer Untersuchungen zu ermöglichen. Wir beginnen mit einer starren Silikonform, die Sie hier sehen, und übertragen diese anschließend in flexible PDMS-Konsolen, die wir hier sehen.

Mithilfe dieser Technik können wir die Auslenkungen einzelner Konsolen unter einem Mikroskop messen und daraus die zellulären Zugkräfte mit der erforderlichen Größe und Richtung berechnen, um solche Auslenkungen hervorzurufen. Wir haben diese Substrate in M-Pads für Mikroposten-Array-Detektoren umgewandelt, und in diesem Video zeigen wir Ihnen, wie man die M-Pads herstellt – beginnend mit dem Silikon-Original, über die PDMS-Replikation bis hin zur Berechnung der Modulation und zellulären Kontraktilität. Hallo, hier sind wir in unserem Labor-Reinraum.

Dies ist ein staubfreier und lichtempfindlicher Raum, der es uns ermöglicht, die SU-8-Säulen herzustellen, die als Silikon-Abformung dienen werden. Zunächst beginnen wir mit einer Siliziumscheibe, die wir mit SU-8-Photoresist beschichten. SU-8 ist ein negativer, lichtempfindlicher Resist. Wenn wir daher Licht durch diese Fotomaske leiten, wird das Licht die Mikrosäulen strukturieren und so eine dreidimensionale Struktur erzeugen, die anschließend die SU-8-Säulen ergibt, die wir dann in PDMS abgießen.

Nachdem wir alle Verarbeitungsschritte abgeschlossen haben, sieht der Wafer wie folgt aus, wobei die Mikrosäulen, also die mikroskaligen Pfostenstrukturen, bereits in den Wafer eingebracht wurden. Um die Master herzustellen, beginnen wir zunächst mit einem unbehandelten Siliziumwafer, der sieben Minuten lang mit einer Ozonbehandlung gereinigt und außerdem 30 Minuten bei 120 Grad Celsius getrocknet wurde. Anschließend applizieren wir SU-8 2002 durch Aufspinnen auf diesen Wafer, um eine sehr dünne Basisschicht für die Pfosten zu bilden.

Da wir SU-8 spinzen werden, trage ich eine Atemschutzmaske, lege das Wafer in diesen Halter erneut ein, entferne eventuell vorhandenen Staub, platziere es auf dem Spinner, überprüfen, ob es zentriert ist, und gießen anschließend SU-8 2002 darauf. Danach beginnen wir mit dem Spinnen des Wafers. Anschließend stellen wir diese auf die Heizplatte zur weichen Aushärtung.

Wir führen dies anschließend eine Minute lang durch. Danach nehmen wir es und übertragen es auf die 95 °C heiße Heizplatte. Und wir führen dies zwei Minuten lang durch.

Und wenn es abgeschlossen ist, nehmen wir dies nun und führen die Flutbelichtung im Maskenaligner durch. Okay, wir haben gerade SU-8, die erste Schicht aus SU-8, auf diesem Wafer spin-beschichtet, und nun müssen wir den gesamten Wafer belichten, um die erste Basisschicht für die Mikrostifte zu erzeugen. Dazu benötigen wir eine Belichtungsdosis von 70 Millijoule.

Daher müssen wir dann die tatsächliche Intensität des Lichts in unserem Maskenstepper hier messen. Dazu platzieren wir das Messgerät im Maskenstepper und belichten es anschließend mit Licht.

Hier liegt UV-Licht vor. Wir laden die Siliziumwafer auf den Maskenaligner und platzieren sie in den Maskenaligner. Dieses Mal verfügen wir über keine Maske, sodass wir den gesamten Film belichten können.

Stellen wir nun den Verschluss zu und stellen eine Belichtungszeit von einer Minute ein, und wir führen die Belichtung durch. Nach einer Minute ist die Belichtung abgeschlossen, und wir können den Wafer entnehmen. Nun müssen wir den Post-Exposure-Bake durchführen.

Wir haben diesen Wafer gerade belichtet und werden nun Wärme zuführen, um die Vernetzungsreaktion für diese erste Beschichtung mit SU-8 auszulösen. Dazu stellen wir ihn eine Minute lang auf eine 65 °C heiße Heizplatte und übertragen ihn anschließend auf eine 95 °C heiße Heizplatte für zwei Minuten. Nach Ablauf der zwei Minuten schalten wir die Heizplatte aus und lassen den Wafer auf Raumtemperatur abkühlen, was etwa 30 Minuten dauert.

Wir haben also die zweite Schicht SU-8 auf diesen Wafer aufgeschleudert. Nun müssen wir diese tatsächlich durch die Fotomaske belichten. Dieses Mal verwenden wir einen UV-Filter, um das tiefe UV-Licht auszublenden.

Dies ist ein optisches Hoya-Glas, das Sie erhalten können, aber diesmal müssen wir erneut die Intensität messen. Dazu verwenden wir unser Lichtmessgerät oder den Filter oben, um die herausgefilterte Intensität zu messen. Anschließend laden wir die Maske in den Maskenaligner ein.

Dieser Schalter erzeugt ein Vakuum, das die Maske an ihrem Platz hält. Anschließend werden wir sie in den Maskenaligner einsetzen. Danach platzieren wir den Filter darauf und laden unseren Wafer ein.

Wir möchten sicherstellen, dass guter Kontakt besteht, daher heben wir ihn an, um Kontakt herzustellen, und beginnen dann die Belichtung. Nach der Belichtung entnehmen wir unseren Wafer aus dem Maskenaligner. Nun haben wir Bereiche, die selektiv belichtet wurden. Dies überführen wir in den Ofen, auf die Heizplatten, um die Post-Exposure-Bake-Behandlung durchzuführen.

Wir haben soeben den PO, den endgültigen Nachbelichtungsbake, durchgeführt und werden nun diesen Wafer entwickeln, um die dreidimensionalen Strukturen zu erhalten. Dazu waschen wir ihn in P-G-M-E-A, wodurch das nicht belichtete SU-8 entfernt wird. Zunächst beginnen wir in einer Schale mit P-G-M-E-A und legen den Wafer hierfür zwei Minuten unter leichtem Schütteln hinein.

Ich werde dies nun zwei Minuten lang laufen lassen. Danach überführen wir in eine zweite Schale mit P-G-M-E-A. Dadurch wird das gesättigte P-G-M-E-A mit SU acht entfernt.

Nach 10 Sekunden überführen wir es in IPA. Dadurch wird das P-G-M-E-A entfernt. Wir geben es erneut für 20 Sekunden hinein, wiederum mit leichter Bewegung.

Und dann haben wir jetzt die freistehenden Pfostenstrukturen. Wir werden dies also in Hexan geben, das eine geringe Oberflächenspannung aufweist. Wir waschen fünf Sekunden lang in erstem und dann in zweitem Hexan und können es danach abtrocknen.

Wir haben das Wafer gerade entwickelt und werden es nun auf eine Heizplatte legen, um die Temperatur langsam auf 150 °C anzuheben. Bei dieser höheren Temperatur kommt es zu einer weiteren Vernetzung des SU-8, wodurch das Material strukturell stabiler wird. Das Wafer bleibt über Nacht auf der Heizplatte, also zwischen 14 und 20 Stunden. Danach schalten wir die Heizplatte aus und lassen das Wafer wieder auf Raumtemperatur abkühlen.

Was wir tun müssen, ist, diese Scheibe in ein kleineres Format zu zerschneiden. Im Grunde genommen möchten wir diese Siliziumscheibe schneiden und einen kleinen Chip mit genau diesem inneren Muster hier erzeugen. Und es wird ungefähr so eine Struktur wie dort aussehen, wo sie Epoxidharz verwenden werden.

Und wir werden diesen Chip wie folgt auf einen Glasobjektträger kleben. Dadurch erhalten wir eine strukturelle Abstützung. Das Zerschneiden eines Wafers ist gewissermaßen eine Kunst, aber im Grunde verwenden Sie dazu einen Diamantschreiber und beginnen an einer Kante.

Und aufgrund der Kristallebenen setzen Sie nun eine kleine Kerbe. Dadurch entsteht ein Bruch, den ich dann mit diesem Werkzeug antippen kann. Dieses Stück können wir abziehen, und anschließend können wir hier weitere Schnitte ausführen, bis wir eine kleine Struktur wie diese erhalten. Danach platzieren Sie den Siliziumchip schnell auf dem Glas und befestigen ihn an der richtigen Stelle. Und Sie lassen das aushärten.

Und so haben Sie am Ende ein Gerät, das diesem hier ähnelt. Wir haben den Silikon-Abdruckträger auf diesen Objektträger montiert und werden ihn nun mit einer Floy-Beschichtung versehen, die später das Freisetzen dieser Struktur aus PDMS erleichtern wird. Dazu werden wir den Chip in diesen Exsikkator stellen und anschließend einige Tropfen dieser Trichlorsilan-Lösung in den Exsikkator geben.

Wir führen dies im Abzug durch, da dabei ein Nebenprodukt in Form von chlorwasserstoffhaltigem Gas entsteht, das ziemlich aggressiv ist. Schließen Sie nun den Deckel, verbinden Sie dies mit Vakuum und lassen Sie es anschließend unter Vakuum stehen, damit sich eine gleichmäßige Beschichtung über die gesamte Siliziumscheibe absetzen kann, was über Nacht erfolgt. Hallo, ich bin Wesley Ligan.

Ich bin Doktorand in Christophers Chen Labor. Bis zu diesem Punkt hat Nate Ihnen gezeigt, wie man eine Silikonform für unsere ED-Substrate herstellt. Bevor wir dieses Werkzeug jedoch verwenden können, um die zelluläre Kontraktilität zu messen, ist es zunächst notwendig, die starren Fotostrukturen mithilfe eines elastomeren Silikonpolymers zu replizieren.

Unsere erste Aufgabe besteht darin, eine Negativform des zuvor hergestellten Silikon-Abdrucks zu erzeugen. Dazu verwenden wir ein Silikonelastomer namens PDMS oder Polymethylsiloxan für unser PDMS-Polymer. Nun fügen wir ein Verhältnis von eins zu zehn an Härtungsmittel hinzu.

Nachdem wir die Lösung abgewogen haben, ist es notwendig, das PDMS-Polymer und das Vernetzungsreagenz gründlich zu mischen. Dieses Mischen führt offensichtlich zu einer Vielzahl von Luftblasen in unserer Lösung. An diesem Punkt ist es daher erforderlich, sie abzudecken und im Vakuumexsikkator zu entgasen.

Sobald das PDMS vollständig entgast ist und alle Blasen an die Oberfläche aufgestiegen und geplatzt sind, können wir es aus dem Vakuum-Exsikkator entfernen. Wir können nun diese Mischung aus PDMS und Vernetzungsreagenz verwenden, um eine Negativform unseres Silikon-Originals zu erzeugen. Dazu verwenden wir eine Backform und platzieren unser montiertes Silikon-Original in deren Mitte.

Anschließend gießen wir die Polymerlösung der DGAs vorsichtig in die Schale über die Siliziumwafer, wobei wir versuchen, die Bildung zusätzlicher Blasen zu vermeiden. Üblicherweise bemühen wir uns, das Polymer etwa einen Viertelzoll dick einzubringen. Sie können sehen, dass dieser Prozess zwangsläufig einige Luftblasen in die Mischung einführt.

Stellen Sie diese Schale nun etwa 30 Minuten beiseite, damit die Blasen an die Oberfläche steigen und platzen können. Wir sehen, dass nach dem Stehenlassen noch einige Luftblasen an der Oberfläche des PDMS vorhanden sind. Da diese sich jedoch an der oberen Oberfläche befinden, können wir nun einen kurzen Stickstoffstrom verwenden, um verbleibende Blasen platzen zu lassen.

Um die PDMS- und VERNETZUNGSLÖSUNG vollständig zu vernetzen und eine starre Negativabformung unseres Siliziummasters zu erzeugen, backen wir sie 20 Minuten lang bei 110 Grad Celsius. Wir können sehen, dass sich eine dünne PDMS-Schicht auf der Silikonunterlage befindet. Bevor wir die beiden voneinander ablösen können, ist es notwendig, diese Schicht zunächst abzuschneiden.

Dann können wir diese Deckschicht abtrennen und vorsichtig vom Silizium-Substrat ablösen. An diesem Punkt können wir das negative Silizium-Substrat und das negative PDMS-Substrat langsam und vorsichtig vom Silikon-Abformwerkzeug ablösen. In Ordnung, wir führen dies durch, indem wir ein Ende festhalten und das PDMS-Substrat behutsam abziehen.

Sie können die vordere Vorderkante sehen, während das Substrat sich vom Silikon-Original ablöst. Nachdem wir nun die A-P-D-M-S-Negativform unseres Silikon-Originals erstellt haben, können wir diese in vier einzelne Negativformen schneiden, um die endgültigen Pad-Substrate herzustellen. An dieser Stelle ist es wichtig, die Oberseite des Negativ-Substrats nicht mit Pinzette oder Handschuhen zu berühren, um die Oberfläche nicht zu beschädigen.

Zu diesem Zeitpunkt haben wir vier individuelle negative Formen aus der Silikonform hergestellt, die aus Vertiefungen mit drei Mikrometer Durchmesser und neun Mikrometer Tiefe bestehen. Um die erhabenen Hebeloberflächen erneut zu erzeugen, können wir erneut mittels PDMS auf diesen Negativformen gießen, wobei PDI-PDMS verwendet wird. Bevor wir dies tun, ist es jedoch erforderlich, diese Negativformen zunächst durch eine Beschichtung mit einem Fluorid nicht haftend zu machen.

Wir führen dies in einer 100-Watt-Plasmakammer bei voller Leistung für eine Minute durch. Nachdem die Kammer wieder evakuiert wurde und das Plasma zurückkehrt, entsteht ein Iongasfeld, das die PDMS-Oberfläche ätzt und sie haftfähiger für die Fluoro-Cy-Lane-Moleküle macht. Nach dem Entfernen der Negativformen aus dem Vakuum-Exsikkator sieht man hier, dass ein Array aus drei Mikrometer breiten und zehn Mikrometer tiefen Vertiefungen in einer nicht haftenden PDMS-Schicht übrig bleibt.

Um die vertikalen Konsolen, die wir für die mpad-Substrate verwenden, regenerieren zu können, ist es notwendig, erneut mit unserer PDMS-Mischung abzugießen, wodurch wir ein positives, freistehendes Array elastomerer Konsolen erhalten, das exakt dem zuvor hergestellten Silikon-Original nachempfunden ist. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, unsere nicht haftenden Negativformen auf eine Haltevorrichtung zu übertragen, die aus PDMS-Streifen und einem Objektträger aus Glas besteht. Der Grund für diese Vorrichtung wird im nächsten Schritt deutlich.

An dieser Stelle können wir einen kleinen Tropfen unserer bereits entgasten 10:1-Mischung aus PDMS und Vernetzer auf die obere Oberfläche jedes unserer Negativformen auftragen. Es wird nur eine geringe Menge PDMS benötigt, damit es nicht an die Kanten der Negativformen läuft. An dieser Stelle.

Um das PDMS gleichmäßiger auf der Oberseite der Formen zu verteilen, können wir eine mit einer Pinzette greifen, sie umdrehen und vorsichtig mit der benachbarten Form in Kontakt bringen, wobei das PDMS sorgfältig so verteilt wird, dass der gesamte Substratbereich vollständig bedeckt ist. Achten Sie sehr sorgfältig darauf, in diesem Schritt keine weiteren Blasen in die obere PDMS-Lösung einzubringen. Danach kann der Vorgang mit den anderen beiden Vertiefungen und den anderen beiden Formen wiederholt werden. Da wir nun eine gleichmäßigere PDMS-Beschichtung auf der Oberfläche haben, können wir diese Halterung in einen Vakuum-Exsikkator stellen, um eventuell in dem PDMS-Film auf unseren Negativformen eingeschlossene Blasen weiter zu entfernen.

Dieser Vorgang dauert in der Regel etwa 30 Minuten. Während unsere Negativformen entgast werden, können wir die 22 mal 22 Millimeter großen Glas-Substrate reinigen, die später als Befestigungsort für die Pads dienen. Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, mithilfe von komprimiertem Stickstoff eventuelle Staubpartikel abzublasen.

Wir werden die Glasdeckgläser einer Gasplasma-Behandlung aussetzen, wodurch die Oberfläche geätzt und für das PMS haftfähiger gemacht wird, das wir im nächsten Schritt darauf aufbringen werden. Nachdem die obere PDMS-Schicht etwa 30 Minuten lang den DGAs ausgesetzt und die Glasdeckgläser plasmabehandelt wurden, können wir die Vorlage entfernen und die durch das Gasplasma behandelte Oberfläche der Glasdeckgläser mit der PDMS-Schicht auf den Negativformen in Kontakt bringen. Üblicherweise ist es hilfreich, zunächst eine Kante des Glasdeckglases mit dem PDMS in Kontakt zu bringen und dann den Rest des Deckglases langsam absinken zu lassen, sodass sich das PDMS blasenfrei wie eine Folie ausbreitet.

Dies hilft, Blasen, die in den PDMS-Film gelangt sind, zu reduzieren. An dieser Stelle können wir vorsichtig mit der Pinzette auf die obere Oberfläche des Glas-Deckgläschens drücken, um überschüssiges PDMS herauszudrücken und das Deckglas an das PDMS-Kreuz in der Mitte der Vorlage heranzuschieben. Dies verhindert, dass sich das Deckglas bewegt, während das PDMS aushärtet.

Wir wiederholen dies für die anderen Substrate. An diesem Punkt können wir die gesamte Vorlage in den Ofen überführen und bei 110 Grad Celsius für 22 Stunden backen. Nachdem wir die gesamte Anordnung auf Raumtemperatur abkühlen lassen haben, können wir unsere Substrate entfernen, umdrehen und vorsichtig die Negativform vom Deckglas abziehen.

Es ist wichtig, dies langsam und gleichmäßig durchzuführen, um zu vermeiden, dass die Säulen zerquetscht oder vom Glas-Substrat abgerissen werden. Wir können sehen, dass nach dem Abziehen der Negativform ein Array von Konsolbalken übrig bleibt, das exakt dem Silizium-Original nachempfunden ist, nur dass sie nun aus einem flexiblen PDMS-Elastomer bestehen. Gut, an dieser Stelle haben wir Ihnen gezeigt, wie wir das Silizium-Original unserer Emad-Substrate herstellen.

Anschließend haben wir einen Abformprozess verwendet, um mithilfe des elastomeren Polymers A-P-D-M-S eine exakte Replik herzustellen, sodass die Konsolen nun flexibel sind und es der Zelle ermöglichen, sich auszubreiten, zusammenzuziehen und die Konsolen im Prozess abzulenken. An diesem Punkt sind unsere Substrate bereit für die Aufbereitung zur Zellkultur. Nachdem wir nun gesehen haben, wie man Formen herstellt und repliziert, um die EDS herzustellen, werden wir noch einige weitere Schritte durchführen, um die EDS funktionsfähig zu machen, sodass wir Zellen kultivieren und anschließend Zugkräfte analysieren können.

Doch bevor wir dies tun, müssen wir drei Dinge erledigen. Wir müssen die Spitzen der Stifte klebend für Zellen machen. Zweitens müssen wir das PDMS fluoreszenzmarkieren, um die Visualisierung und Analyse der Stiftablenkungen zu erleichtern.

Und drittens müssen wir die Seitenwände und die Basis der Säulen ebenfalls zellunadhäsiv gestalten, damit Zugkräfte ausschließlich an den Säulenspitzen wirken. Im Folgenden werden wir sehen, wie diese Schritte in den nächsten Minuten mithilfe einer Mikrokontaktdruck-basierten Strategie durchgeführt werden. Zunächst erfolgt jedoch der nächste Schritt, bei dem überschüssiges P-D-S-P-D-M-S von den eds entfernt wird.

Wie bereits erwähnt, besteht der erste Schritt darin, das EDS-Substrat zu nehmen, dessen Herstellung und Trimmen von West gerade gezeigt wurde. Das überschüssige PDMS, das sich durch das Aushärten der Glasdeckfolie an der Negativform ergab, wird mit einer scharfen Rasierklinge abgetrimmt. Dies geschieht, indem man die Rasierklinge senkrecht an der Kante der Säulen auf das Substrat setzt und das überschüssige PDMS dann abschabt.

Und Sie können mit einem Finger das Deckglas festhalten, damit es nicht verrutscht. Am Ende haben wir ein M-Pad-Substrat, das von Schmutz befreit wurde und somit leicht zugänglich ist. Für den nächsten Schritt müssen wir die MPAs mittels Mikrokontaktdruck aufbringen, um die Spitzen der Säulen klebend zu machen.

Um dies zu tun, müssen wir zuerst Stempel herstellen, und dieser Prozess ist sehr einfach. Wir mischen PDMS im Verhältnis von 1 zu 30 statt im Verhältnis von 10 zu 1. Anschließend geben wir es in eine Petrischale, sodass die Höhe des PDMS etwa einen Zentimeter beträgt.

Lassen Sie es entgasen. Das bedeutet, dass die Blasen an die Oberfläche des PDMS aufsteigen können. Danach führen Sie die Vernetzungsreaktion im Ofen bei 60 Grad eine Stunde lang durch. Nach dem Entfernen der Schale aus dem Ofen und dem Abkühlen bin ich nun bereit, die Stempel auszuschneiden. Wiederum mit derselben Art von Rasierklinge schneiden Sie einfach, indem Sie vertikal nach unten in das PDMS drücken, bis Sie den Boden der Petrischale erreichen.

Die Ausrichtung des Stempels ist nun etwas, worauf wir achten möchten. Die Stempeloberfläche wird die Seite des PDMS sein, die gegen den Boden der Petrischale gegossen wurde, damit sie flach bleibt. Bei diesem großen PDMS-Quadrat, das ich ausgeschnitten habe, ist die Stempeloberfläche jetzt nach oben gerichtet.

Nun ist dieser Stempel viel größer als die M-Pads, daher werde ich ihn mit dem Rasiermesser wieder auf die Größe eines einzelnen M-Pads zuschneiden. Da es sehr schwierig ist, die korrekte Ausrichtung des Stempels mit bloßem Auge zu erkennen, werde ich eine kleine Kerbe an der Seite anbringen, die später die Rückseite des Stempels – also die Nicht-Oberseite – darstellt, genau so. Anschließend kann ich den Stempel aus dem größeren Block entfernen. Nun habe ich einen A-P-D-M-S-Stempel für den nächsten Schritt.

Wir möchten die PDMS-Stempel reinigen. Da es sehr wahrscheinlich ist, dass während des Schneidens Staub aus der Umgebungsluft auf die PDMS-Stempel gelangt ist, führen wir einen Prozess durch, bei dem wir die gewünschte Anzahl an PDMS-Stempeln in dieses Kristallisationsglas geben und das Kristallisationsglas mit 100 % Ethanol auffüllen.

Geben Sie also einfach so viel Ethanol hinzu, dass die Oberfläche der Stempel bedeckt ist; die genaue Menge an zugesetztem Ethanol ist jedoch nicht wichtig. Anschließend wird die Kristallisationsscheibe in einen Behälter gegeben und die Stempel fünf Minuten lang sonifiziert. Nach Ablauf der fünf Minuten werden die Stempel vollständig sterilisiert, und der verbleibende Teil des Mikrokontaktdrucks – die Funktionalisierung der M-Pads – wird in einer sterilen Zellkulturhaube durchgeführt.

Jetzt befinden wir uns in der Zellkulturfume, wo wir die Stempel fertig sterilisieren können. Dazu nehmen wir die Stempel aus der Kristallisationschale, tauchen sie in eine Schale voller Ethanol, um eventuell verbliebene Rückstände abzuspülen, und tauchen sie anschließend in eine Schale mit Wasser, um den Ethanol abzuwaschen. Danach trocknen wir die Stempel mit einem Strom von Stickstoff, bis keine sichtbaren Tropfen mehr verbleiben.

Der nächste Schritt besteht darin, die Stempel mit einer Proteiniösung zu bestreichen. Die verwendete Proteiniösung enthält 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibrin in DEI-Wasser. Nehmen Sie einfach etwas von der Proteiniösung mit der Pipette auf und geben Sie Tropfen der Proteiniösung auf die Stempelfläche.

Sie möchten dies tun, indem Sie kleine Tröpfchen auf den Rand der Stempelfläche geben. Wiederholen Sie dies zunächst für alle Stempel, die Sie verwenden werden, und ich hätte dies im Voraus tun sollen. Der nächste Schritt, nachdem Sie Punkte auf die Ränder aller Stempel gebracht haben, besteht darin, diese Tröpfchen zu verbinden und die Stempelfläche mit der Proteiniösung zu füllen.

Der Grund dafür ist, dass die Proteiniösung in den Tröpfchen und so weiter unterhalb der Tröpfchen die Stempeloberfläche hydrophil macht, wodurch sich das extrazelluläre Matrixprotein leichter verteilen lässt. Wiederholen Sie dies daher erneut für alle verwendeten Stempel. Nachdem wir nun die Proteiniösung auf der Oberfläche der Stempel verteilt haben, besteht der letzte Schritt beim Einfärben der Stempel darin, sicherzustellen, dass auch die Kanten bedeckt sind. Dazu neigen wir einfach eine Pipette und führen sie entlang der Stempeloberfläche, sodass sowohl die Ecke des PDMS-Stempels als auch die Proteiniösung berührt werden.

Und erneut, wiederholen Sie dies für alle Kanten aller Stempel, die Sie einfärben. Nachdem wir nun die Einfärbung der Stempel abgeschlossen haben, stellen wir diese Stempel für eine Stunde in die Zellkulturhaube, um die vollständige Adsorption des Proteins auf der Stempeloberfläche zu ermöglichen. Nachdem wir nun eine Stunde gewartet haben, damit die Proteine auf der Stempeloberfläche adsorbieren können, ist es nun an der Zeit, sie mit Wasser zu spülen und mit Stickstoff zu trocken zu blasen.

Dazu nehmen wir steriles Wasser und gießen es in die Schale mit den Stempeln. Achten Sie darauf, das Wasser nicht direkt auf die Stempelfläche zu gießen; gegebenenfalls können Sie eine Pipette verwenden. Die genaue Menge des verwendeten Wassers ist nicht entscheidend, solange der Wasserspiegel über der Proteinslösung liegt.

Danach nehmen Sie mit sterilen Pinzetten einen Stempel, tauchen ihn in eine neue Schale mit Wasser und trocknen ihn vorsichtig mit Stickstoff ab. Auch hier erkennen Sie, dass er trocken ist, wenn Sie keine Tropfen der Proteiniösung mehr auf dem Stempel sehen. Wiederholen Sie dies für alle Stempel, die Sie nacheinander bearbeiten.

Nun, da wir die Stempel trocken gespült haben, ist es an der Zeit, die mpad-Substrate durch Behandlung mit UV-Ozon zu aktivieren. Sieben Minuten lang entferne ich den Petrischalen-Deckel von oben, vom oberen Teil der Schale. Da Polystyrol UV-Licht absorbiert, stelle ich die Schale anschließend in den UV-Ozon-Behandler, schließe die Schublade, stelle die Zeit auf sieben Minuten ein und lasse den Vorgang ablaufen.

Jetzt sind wir wieder in der Zellkulturhaube und es ist Zeit, die mpad-Substrate zu stanzen, die zuvor mit UV-Ozon behandelt wurden. Heben Sie dazu die gespülten und getrockneten Stempel mit einer Pinzette an. Sie können die Stempel an den Seiten anfassen, sollten jedoch die Stempelfläche nicht berühren.

Sie sollten den Stempel in der Pinzette so ausrichten, dass die Proteinoberfläche zugänglich ist. Anschließend drehen Sie die Pinzette um, wobei Sie bedenken müssen, dass die Proteinoberfläche nach unten zeigt, und bringen den Stempel langsam mit dem EDS in Kontakt. Die Stempel Nummer eins bis 30 haften stark, sodass Sie möglicherweise ein zweites Paar Pinzetten verwenden müssen, um den Stempel von der Pinzette zu lösen.

Sie können den Stempel aus einer Höhe von etwa zwei Millimetern bis etwa acht Millimetern auf die Emeds fallen lassen. Danach kippen Sie die Schale mit den Emeds leicht an und drücken vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, um Kontakt zwischen dem Stempel und den EDS herzustellen. Sie erkennen den Kontakt auf eine von zwei Arten.

Die erste Methode besteht darin, die ED-Oberfläche durch die Seite des Stempels zu betrachten. Dies kann mit der Kamera schwer zu erkennen sein, aber mit dem Auge kann ich deutlich sehen, dass der Stempel Kontakt mit der Oberfläche hat, wenn ich die Oberfläche durch die Seite des Stempels betrachte. Die zweite Möglichkeit, den Kontakt sicherzustellen, besteht darin, die Petrischale mit aufgesetztem Deckel aus dem Zellkulturwerk zu nehmen und unter einem invertierten Mikroskop zu betrachten.

Indem Sie Interferenzmuster mit dem Mikroskop visualisieren, sollten Sie erkennen können, ob und wann der Stempel mit den eds in Kontakt steht. Sobald Sie den Kontakt festgestellt haben, muss der Stempel nur noch einige Sekunden lang mit dem ed-Substrat in Kontakt bleiben. Es ist nun also an der Zeit, den Stempel zu entfernen.

Um dies durchzuführen, falten Sie die Eds mit einer Pinzette nach unten und ziehen Sie den Stempel in einer fließenden Bewegung ab. Achten Sie darauf, welche Eds Sie bereits gestempelt haben und welche Stempel Sie zuvor bereits verwendet haben. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal pro EMPA für jedes Substrat, das Sie verwenden möchten.

Nachdem wir die EMPAs abgestempelt haben, besteht der nächste Schritt darin, sie zu sterilisieren und anschließend in einem lipophilen Farbstoff namens Dye Eye zu inkubieren. Dai ist ein lipophiles Molekül, das fluoreszenzmarkiert ist und daher über einen bestimmten Zeitraum in das PDMS eindiffundiert, wodurch wir die Post-Deformationen unter dem Mikroskop sichtbar machen können. Ich werde nun nacheinander jedes einzelne EMBA-Substrat nehmen und es in 100 % Ethanol, 70 % Ethanol, DI-Wasser, DI-Wasser, DI-Wasser, DI-Wasser eintauchen.

Und schließlich eine Lösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter DII. Da die DII-Lösung fluoreszierend ist, decken wir die Schalen mit Aluminiumfolie ab, um die Belichtung mit Umgebungslicht zu minimieren und eine Photobleiche zu vermeiden, während sie eine Stunde lang im Zellkulturwerk inkubieren. Nachdem wir eine Stunde gewartet haben, bis die EM-Pads in der DAI-Lösung inkubiert wurden, können wir die Aluminiumfolie entfernen und die DAI-Lösung ausspülen.

Wir spülen die Probe durch drei aufeinanderfolgende Eintauchungen in sterilisiertes Wasser aus und tauchen sie schließlich in eine Lösung von 0,2 % ionic F1 27 ein. Das entspricht 0,2 % Gewicht pro Volumen. Während aller Eintauchschritte ist es wichtig, die Zeit, in der die EM-Pads der Luft ausgesetzt sind, zu minimieren. Dies dient dazu, Schäden an den ED-Substraten zu verhindern und insbesondere zu verhindern, dass zwei Posts aufeinander kollabieren.

Das 0,2 %ige F1 27 ist ein triblock-copolymeres Molekül, das aus hydrophilen und hydrophoben Bereichen besteht. Der hydrophile Bereich ist dafür bekannt, die Proteinaufnahme und somit die Zelladhäsion zu verhindern, während der hydrophobe Bereich an die Oberfläche des hydrophoben PDMS bindet. Wenn PDMS daher in F1 27 getaucht wird, bindet sich F1 27 an das PDMS und verhindert die Zelladhäsion.

Nach einer Stunde Inkubation in chronischem F1 27 in einer mit Aluminiumfolie abgedeckten Petrischale können wir das F1 27 durch mehrmaliges Eintauchen in sterilem Wasser, sterilem Wasser und PBS ausspülen. Nach dem Eintauchen in PBS und dem vollständigen Entfernen des Produkts F1 27 können wir die Substrate dann in eine geeignete Zellkultur-Lösung eintauchen. Die Zellkultur-Lösung, in die ich die EMPAs soeben eingetaucht habe, kann Serum und/oder andere Wachstumsfaktoren sowie Zusätze wie Penicillin und Streptomycin enthalten.

Alle diese Bestandteile sind vollständig kompatibel mit den EMPA-Behandlungen. Der nächste Schritt besteht darin, nachdem die EDS in Zellkultur-Lösung eingetaucht wurden, die gewünschten Zellen auf die EDS auszusäen. Für diesen speziellen experimentellen Aufbau werde ich bovine pulmonale aortale Endothelzellen in drei verschiedene Petrischalen aussäen.

Der Grund dafür, warum ich drei verschiedene Schalen verwende, liegt darin, dass ich zwei der Schalen mit bekannten Taktilitätsinhibitoren behandeln werde, um die Auslenkung der Säulen zu hemmen, was wir zu einem späteren Zeitpunkt mittels Assay überprüfen können. Um die Zellen auszusäen, nehme ich einfach meine Zellsuspension, saugte die entsprechende Menge in die Pipette auf und pipettieren sie tropfenweise in jede Schale. Ich gebe ausreichend Zellen hinzu, sodass die Zellen bei Durchführung des Assays zur Messung der Zugkräfte als Einzelzellen auf den Säulen vorliegen.

Die Menge, die Sie hinzufügen, hängt von der Ausstreubreite sowie von der Wachstumsrate Ihrer spezifischen Zellen ab. Üblicherweise säen wir zwischen 1500 und 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter Substrat. Nachdem Sie die Zellen ausgesät oder die Zellsuspension bearbeitet haben, geben Sie die Suspension tropfenweise in die Kultur und schwenken die Kultur mehrmals vorsichtig hin und her in orthogonalen Richtungen, um die Zellsuspension in der Kulturschale zu verteilen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Substrate, die Sie verwenden. Unmittelbar nach dem Aussäen der Zellen stellen Sie diese in einen 37-Grad-Inkubator mit einem geeigneten Kohlendioxidgehalt, um den pH-Wert und das Zellkulturmedium zu puffern. Ungefähr zwei Stunden nach dem Aussäen der Zellen ist es angebracht, die Zellen zu waschen, indem Sie die Substrate von einer Schale mit Medium in eine frische Schale mit demselben Zellkulturmedium überführen.

Der Grund für diese Spülung liegt darin, dass die meisten Zellen innerhalb von zwei Stunden mit der Ausbreitung begonnen haben und nahezu ihre endgültige ausgebreitete Fläche erreicht haben. Durch das Spülen der Zellen, also der Substrate, entfernen Sie alle schwimmenden Zellen aus dem Zellkulturmedium. Auf diese Weise werden nur Zellen, die an der EDS angeheftet sind und mit dem Ausbreitungsprozess beginnen, in der Endpunktanalyse für Zugkräfte sichtbar.

Eine Untersuchung, die wir mit Zellen durchführen können, die auf MPAs kultiviert wurden, ist die Zeitrafferaufnahme, um die Dynamik der zellulären Kontraktilität quantitativ zu untersuchen. Insbesondere sind die dynamischen Veränderungen der zellulären Kontraktilität als Reaktion auf lösliche Faktoren von Interesse. Bekanntermaßen können lösliche Faktoren wie biologische und synthetische Verbindungen die zelluläre Kontraktilität verstärken, abschwächen oder haben unbekannte Wirkungen darauf.

Für dieses Live-Cell-Experiment verwenden wir ein aufrechtes Epi-Fluoreszenzmikroskop. Auf der Mikroskoptischplatte befindet sich eine kleine Inkubationskammer, die an einen Temperaturregler angeschlossen ist, um die Temperatur bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 zu halten. Wir werden mit einer 60×-Plan-Apo-Objektivlinse mit hoher Vergrößerung abbilden.

Nun bereiten wir das Wirkstoff-Substrat für die Bildgebung vor. Das 60x-Objektiv, das wir für die Aufnahme verwenden, hat eine Arbeitsweite von 200 Mikrometern, was deutlich dünner ist als die Dicke der Zellkulturschale, in der wir die Zellen zuvor ausgesät haben. Daher können wir die Zellen auf den Implantaten in der Zellkulturschale nicht abbilden.

Um dieses Problem zu umgehen, verwenden wir diese Glasbodenkulturen. Ich werde nun das Substrat kopfüber in die Glasbodenkultur überführen, sodass die Zellen und die Spitzen der Säulen an der Grenzfläche des Glasbodens liegen. Wenn dies also unter das Mikroskop gelegt wird, beträgt der Arbeitsabstand zwischen den Zellen und der Objektivlinse weniger als 200 Mikrometer.

Nun können wir mit der Bildgebung unter dem Mikroskop beginnen. Ich öffne nun die Inkubationskammer für Lebendzellen, lege die Probe hinein und schließe den Deckel der Inkubationskammer. Anschließend durchsuche ich das Substrat nach einer geeigneten Zelle.

Zur Bildgebung. Die effizienteste Methode hierfür besteht darin, ein 10x-Objektiv mit Phasenkontrast zu verwenden, wodurch ich ein breiteres Sichtfeld des Substrats einstellen und schneller eine Zelle finden kann. Mein Kriterium für eine geeignete Zelle ist eine einzelne Zelle.

Es sollte keine benachbarten Zellen berühren und außerdem im Vergleich zu allen anderen Zellen auf dem Substrat durchschnittlich groß sein. Ich habe eine geeignete Zelle zum Betrachten gefunden. Als Nächstes wechsle ich das Objektiv auf 60x, um die Zelle mit hoher Vergrößerung zu betrachten. Dazu entfokussieren wir das Objektiv, damit es während der Drehung nicht mit dem Objekttisch kollidiert.

Während der Drehung des Revolvers öffnen Sie die Kammer, drehen Sie das 60x-Objektiv teilweise, bis das 60x-Objektiv in Position ist. Das 60x-Objektiv ist ein Öl-Immersion-Objektiv, daher müssen wir einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv geben. Nun schließen wir die Drehung des Revolvers ab, um das 60x-Objektiv vollständig in Position zu bringen. Wir schließen die Inkubationskammer und stellen das Objektiv erneut scharf, um die Zelle wieder in den Fokus zu bringen.

Nachdem ich die Position und den Fokus der Zelle feinjustiert habe, schalte ich auf die CCD-Kamera um, um die Zelle auf dem Computerbildschirm vorab anzuzeigen und anschließend die Zeitrafferaufnahme zu starten. Für dieses Experiment werde ich sowohl Phasenkontrast- als auch Fluoreszenzbilder in einem Intervall von einer Minute aufnehmen. Die Zeitrafferaufnahme hat nun begonnen, und ich lasse sie zehn Minuten lang oder für zehn Bilder laufen. Zu diesem Zeitpunkt füge ich das Serum hinzu. Zehn Minuten sind nun vergangen. Jetzt öffne ich die Kammer und gebe Serum in die Petrischale, um die Kontraktilität der Zelle zu stimulieren.

Der Timer läuft noch, daher muss ich hierbei schnell vorgehen. Nun werden wir die Zelle weitere 30 Minuten abbilden, um mögliche Veränderungen der Kontraktilität zu verfolgen. Nach Abschluss der Zeitrafferaufnahmen können die Bilder zu einem Film zusammengesetzt werden. Hier sind zwei Filme mit den Phasen- und Fluoreszenzbildern.

Links ist ein Phasenfilm einer weitgehend transparenten Zelle, die in Schwarz umrissen ist. Die Zelle erstreckt sich über die Spitzen von 20 Säulen, welche die kreisförmigen Strukturen in einem rechteckigen Gitter darstellen. Rechts ist ein Fluoreszenzfilm derselben Zelle zu sehen, wobei jedoch nur die Säulen sichtbar sind.

Wenn ich diese Filme abspiele, werden Sie sehen, dass die mit der Zelle verbundenen Stifte anfangs schwach sind, leicht abgelenkt werden und nur geringfügig vom rechteckigen Gitter abweichen. Gegen die Mitte des Films hin habe ich Serum dem Medium hinzugefügt. Das Serum stimuliert die Zelle, ihre Kontraktilität zu erhöhen.

Wenn die Zelle stärkere Zugkräfte auf die darunterliegenden Säulen ausübt, beginnen sich die Säulen entlang des Zellrands nach innen zu verformen. Im fluoreszierenden Film sehen Sie nun, dass die Säulen deutlich von ihren Positionen im rechteckigen Gitter abweichen. Wie ich später beschreiben werde, können die Verschiebungen dieser Säulenpositionen in diesen Bildern zur Analyse der Zugkräfte dieser Zelle verwendet werden.

Zuvor haben wir gesehen, wie wir die mpad-Substrate hergestellt und funktionalisiert haben, um Zellen darauf kultivieren zu können. Sie werden nun bemerkt haben, dass ich die fertigen mpad-Substrate in drei verschiedene Zellkulturschalen gegeben habe. Die Zellen sind über Nacht gewachsen, und nun werde ich jede einzelne Zellkulturschale mit einem unterschiedlichen löslichen Wirkstoff behandeln, der die Kontraktilität auf bekannte Weise moduliert.

Anschließend können wir quantitativ die Zugkräfte messen, die sich nach der Fixierung der Zellen nach 30 Minuten ergeben. Nach Zugabe der löslichen Faktoren 30 Minuten nach der Zugabe der Kontraktilitätsinhibitoren ist es nun an der Zeit, die Zellen mit Paraformaldehyd zu fixieren, um den aktuellen Zustand der Zugkräfte festzuhalten. Dazu ist es wichtig, Paraformaldehyd zu verwenden, das Calcium und Magnesium enthält, und wir verwenden Paraformaldehyd in einem Volumenanteil von 3,7 %. Die Methode zum Eintauchen der Substrate in Paraformaldehyd, Entschuldigung, ist dieselbe wie die Methode zum Eintauchen der Substrate in diese, in die verschiedenen RINs während der Funktionalisierung.

Das heißt, es ist wichtig, die Substrate nicht austrocknen zu lassen, da dies zum Kollaps nach der Prozedur führen könnte. Nachdem ich die Substrate übertragen habe, lasse ich sie 20 Minuten lang in der Paraformaldehyd-Lösung inkubieren. Nach Ablauf der 20 Minuten entfernen wir die Substrate nun aus dem Paraformaldehyd, und da die Zellen nun fixiert sind, können wir diese Proben für eine Standard-Immunfärbung weiterverarbeiten.

Dazu legen wir die Substrate mit der Oberseite nach oben auf Param und pipettieren so viel PBS darauf, dass das Substrat bedeckt ist und unterhalb des PBS bleibt. Anschließend spülen wir das Substrat dreimal mit PBS, um eventuell im Kulturmedium verbliebenes Paraformaldehyd zu entfernen. Nach dem dreimaligen Spülen des Substrats mit PBS kann das Substrat für die nachfolgende Immunfärbung weiterverarbeitet werden.

Wir führen dies durch, indem wir das Substrat mit einer Pinzette handhaben und im ersten Schritt der Immunfärbung umdrehen, und zwar in ein Permeabilisierungsmittel. In diesem Fall verwenden wir 0,2 % Triton X in PBS. Der Anwender kann jedoch jedes Permeabilisierungsmittel verwenden, das am besten seinen Anforderungen entspricht.

Wir wiederholen dies für alle unsere Substrate, und so gehen wir während des Immunfärbeprozesses mit den Substraten um. Nach der Immunfärbung werden die Substrate auf einen standardmäßigen Objektträger mit einer Größe von einem Zoll mal drei Zoll montiert, der dann an jedem Epi-Fluoreszenzmikroskop, ob invertiert oder aufrecht, bearbeitet werden kann. Durch die Bearbeitung der Proben an einem Konfokalmikroskop können wir uns auf das untere Ende der Pfeiler konzentrieren, um die unverzerrten, also Nullpositionen, zu erhalten.

Dann können wir bis zu den Spitzen der Säulen fokussieren, ein weiteres Bild der Säulen aufnehmen und durch den Vergleich des oberen mit dem unteren Bild die Ablenkungen der Säulen messen sowie die Zugkräfte der Zellen berechnen, die die Zellen erzeugt haben, um solche Ablenkungen hervorzurufen. Indem wir diesen Vorgang für viele verschiedene Zellen unter mehreren unterschiedlichen Bedingungen durchführen, können wir anschließend die in den verschiedenen Bedingungen erzeugten Zugkräfte miteinander vergleichen. Nachdem wir nun Bilder sowohl lebender als auch fixierter Zellen gesammelt haben, besteht unsere nächste Aufgabe darin, die Ablenkung zu messen und die Zugkräfte in den Zellen zu bestimmen.

Dazu haben wir ein Computerprogramm in Matlab verfasst. Dies sind die drei Bilder, die wir in dieser Analyse verwenden werden. Das erste Bild ist ein Phasenbild der Zelle.

Es ist hilfreich, um die Position der Zelle zu bestimmen. Das zweite Bild ist eine Fluoreszenzaufnahme der Oberseiten der Säulen. Mithilfe dieses Bildes bestimmen wir die Positionen der Säulen an deren Spitzen.

Wie Sie sehen können, werden einige dieser Pfosten abgelenkt und weichen von dem rechteckigen Gitter ab, in dem sich die meisten Pfosten befinden, wie zum Beispiel dieser Pfosten und dieser Pfosten. Das dritte Bild, das wir verwenden werden, ist das Basisbild, das die Position der Pfosten in einer Fokalebene erfasst, die durch deren Basis verläuft.

Auf dieser Ebene sollten sowohl die abgelenkten als auch die nicht abgelenkten Säulen in ihrer Ruhelage, also in unverformten Positionen, stehen. Im rechteckigen Gitter kann man erkennen, dass die Säulen, die im zweiten Bild an ihrer Basis abgelenkt waren, sich nun in ihrer FL-Position befinden. Dieses Bild wird verwendet, um die Position der Säule in ihrer unteren, reflektierten Lage zu bestimmen.

Danach laden wir das MATLAB-Programm, das uns auffordert, diese drei Bilder zu laden. Geben Sie der Datei einen Namen. Sie sehen das Phasenbild.

Wir zeichnen einen Rahmen um den Bereich, in dem sich die Zelle befindet, damit das Programm weiß, welche Säulen analysiert werden sollen. Anschließend führt das Programm eine Intensitätsanalyse, Schwellenwertbestimmung und ization des zugeschnittenen Bildes durch, um die OID-Koordinaten der Säulen zu bestimmen. Auf der linken Seite sind ized Bilder der Säulen aus dem oberen Bild, während auf der rechten Seite ized Bilder derselben Säulen aus dem Basisbild zu sehen sind.

Nachdem die Pfosten und OID-Koordinaten erfasst wurden, kann das Programm anschließend die Verschiebungsvektoren zwischen der Spitze und der Basis jedes Pfostens bestimmen. Diese Verschiebungsvektoren der Pfosten können in Kraftvektoren umgewandelt werden, indem sie mit der Federkonstante des Pfostens multipliziert werden. Diese zellulären Kräfte können auf verschiedene Weise analysiert werden, beispielsweise als durchschnittliche Kraft pro Zelle oder durchschnittliche Kraft pro Pfosten.

Ein nützliches Ergebnis ist ein Quiver-Plot, mit dem wir die räumliche Verteilung der Kräfte visualisieren können. Dies ist die Zelle, die wir gerade analysiert haben, und Sie können sehen, dass ich gelbe Pfeile über die Posts gelegt habe, die mit der Größe der Kraft korrelieren und in die Richtung der Kraft zeigen. Indem wir diesen Bildanalyseprozess für Bilddatenreihen wiederholen, wie sie in unserem Zeitraffervideo benötigt werden, können wir eine zeitliche Abfolge erzeugen.

Hier ist ein Film der Zelle, die wir mit Serum stimuliert hatten. Wie Sie sehen können, nahm die Kontraktilität der Zelle unmittelbar nach Zugabe des Serums zu und lenkte die Pflöcke noch stärker ab. Zusätzlich können wir die Kräfte für größere Zellzahlen quantifizieren, die unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und anschließend fixiert und gefärbt wurden, wie durch diese Quiver-Diagramme veranschaulicht, die eine Zelle nach Behandlung mit einer Kontrollsubstanz im Vergleich zu Zellen nach Behandlung mit Kontraktilitätsinhibitoren zeigen.

Wie Sie sehen können, sind die Kraftvektoren an der Zelle im Kontrollfall länger und somit betragsmäßig größer als die Kraftvektoren in den beiden Fällen, in denen Kontraktilitätsinhibitoren verwendet wurden. Wir haben hier viel Material behandelt, um den Pfad des Substrats von der Mikrofertigung über die Probenvorbereitung, die Experimente und die Analyse hinweg zu beschreiben, um die Vielseitigkeit dieser Substrate zu demonstrieren.

Wir haben zwei verschiedene Assays beschrieben, die Live-Cell-Bildgebung und den Fixprobe-Assay, und die Analyse von Zellen durchgeführt, die aus beiden Assays gewonnen wurden, sowie Quiver-Diagramme und Quiver-Videos gezeigt. Mit diesem leistungsstarken Werkzeug können vielfältige räumliche und zeitliche Analysen der Zellkontraktilität durchgeführt werden. Wie Sie gesehen haben, baut diese Methode auf vielen verschiedenen Disziplinen auf, darunter Mikrofertigung, Grundlagen der Zellbiologie, Oberflächenwissenschaft, Bildanalyse und -verarbeitung sowie zahlreiche andere.

Und gerade weil seine Methode auf mehreren verschiedenen ingenieurwissenschaftlichen Techniken basiert, können Parameter wie die Geometrie der Säulen, die induzierten löslichen Faktoren und die Methoden zur Analyse der Säulenauslenkungen je nach den Anforderungen des Anwenders angepasst werden. Wir hoffen, dass die visuelle Darstellung dieser Methode, die wir in den letzten 20 bis 30 Minuten erläutert haben, als Ausgangspunkt für weitere und tiefgreifendere Analysen der Regulation, funktionellen Konsequenzen und Entstehung zellulärer Anziehungskräfte dienen kann.