Mikrofabrizierten Post-Array-Detektoren (mPADs): Ein Ansatz zur Mechanical Forces Isolate

Hallo, ich bin Nathan Snia Decky und bei mir Heute sind Wes Ligan und Robbie Desai und Mike Yang. Und wir sind aus dem Labor von Chris Chen hier an der University of Pennsylvania. In diesem Video stellen wir unseren Ansatz zur Messung zellulärer Anziehungskräfte mit Hilfe eines mikrofabrizierten Arrays von Pfosten vor.

Zugkräfte werden durch Myosin- und Aktonwechselwirkungen erzeugt und spielen eine wichtige Rolle in unserer Physiologie. Während der Entwicklung ermöglichen sie es den Zellen, sich von einem Ort zum nächsten zu bewegen, um die frühen Strukturen unseres Gewebes zu bilden. Und sie helfen auch im Heilungsprozess, da sie für den Verschluss von Wunden oder die Wanderung und das Kriechen von Leukozyten durch unseren Körper notwendig sind.

Aber leider können dieselben Kräfte im Falle von Krebsmetastasen oder Gefäßwachstum in Richtung eines Tumors schädlich für unsere Gesundheit sein. Es gibt also nur sehr wenige Methoden, mit denen man diese Zugkräfte tatsächlich quantitativ messen kann, und zwar vor allem auf der Mikro- und Nanoskala einzelner Zellen. Die meisten der gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung von Zellen in vitro waren Glasschalen oder Styroporschalen, aber das sind sehr starre Substrate, und das sind sie nicht, sie erlauben es uns nicht, die Zugkräfte und die Diffamierungen, die eine Zelle verursacht, tatsächlich physisch zu messen.

Und so war es sehr schwierig, die zugrundeliegenden Mechanismen der Zugkräfte ohne irgendeine Art von physikalischer Anzeige zu verstehen. Und so haben wir in Chris Chens Labor eine Technik, die es uns ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden. Unser Verfahren basiert auf einer vertikalen Anordnung flexibler Ausleger, deren Steifigkeit und Größenskala so beschaffen sind, dass sich einzelne Zellen auf mehrere Ausleger verteilen und diese dabei ablenken.

Die Abmessungen, die wir am häufigsten verwenden, sind drei Mikrometer Durchmesser, zylindrische Pfosten mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern mit einem Abstand von neun Mikrometern von Mitte zu Mitte und einer rechteckigen Anordnung. Diese Dimensionen können jedoch variiert werden, um eine Vielzahl von zellulären Studien zu ermöglichen. Wir beginnen mit einem starren Silizium-Master, den Sie hier sehen können, und übersetzen diese dann in flexible PDMS-Ausleger, die wir hier sehen.

Mit dieser Technik können wir die Auslenkungen einzelner Ausleger unter dem Mikroskop messen und die zellulären Zugkräfte mit der Größe und Richtung zurückbilden, die zur Erzeugung solcher Auslenkungen erforderlich ist. Wir haben diese Substrate in M-Pads für Micro-Post-Array-Detektoren verwandelt und zeigen Ihnen in diesem Video, wie Sie die M-Pads herstellen, beginnend mit dem Silikon-Master über die PDMS-Replikation bis hin zur Berechnung der Modulation und zellulären Kontraktilität. Hallo, hier sind wir im Reinraum unseres Labors.

Dies ist ein staubfreier und lichtempfindlicher Raum, der es uns ermöglicht, die SU aus acht Pfosten zu machen, die als Silikonmaster dienen werden. Wir beginnen zunächst mit einem Siliziumwafer und beschichten ihn mit SU Eight Photo Resist, SU Eight ist ein Negativlack und er ist lichtempfindlich. Wenn wir also Licht durch diese Fotomaske strahlen, bewirkt es, dass das Licht die Mikropfosten strukturiert und dann eine dreidimensionale Struktur bildet, die dann aus den acht Pfosten der SU besteht, die wir dann in PDMS gießen.

Nachdem wir also alle unsere Prozesse abgeschlossen haben, wird der Wafer so aussehen, wo wir die Mikrosäule haben, die Mikropoststrukturen, die bereits in den Wafer eingearbeitet sind. Um die Master zu erstellen, beginnen wir zunächst mit einem blanken Siliziumwafer, der sieben Minuten lang mit Ozon gereinigt wurde, und wir haben diesen Wafer auch 30 Minuten lang bei 120 Grad Celsius dehydriert. Wir werden SU eight 2002 darauf spinnen, um eine sehr dünne Basisschicht für die Pfosten zu bilden.

Da wir also SU Eight drehen werden, werde ich eine Gasmaske tragen, den Wafer wieder in diesen Halter hier laden, jeglichen Staub abstauben, der sich dort befinden könnte, ihn auf den Spinner legen, wir werden überprüfen, ob er zentriert ist. Und dann werden wir den SU Eight 2002 darüber gießen. Und dann drehen wir den Wafer. Diese legen wir dann auf die Herdplatte, den Soft Bake.

Wir machen das danach eine Minute lang. Dann nehmen wir es und übertragen es auf die 95 Grad heiße Platte. Und das tun wir zwei Minuten lang.

Und wenn es fertig ist, nehmen wir das jetzt und gehen los, um die Flutbelichtung im Masken-Aligner zu machen. Okay, wir haben gerade SU Eight gesponnen, die erste Schicht von SU Eight auf diesem Wafer, und jetzt müssen wir den gesamten Wafer fluten, um die erste Basisschicht für die Mikropfosten zu erstellen. Wir müssen dem also eine Belichtung von 70 Millijoule geben.

Wir müssen dann dann die tatsächliche Intensität des Lichts in unserem Mask Aligner hier messen. Also laden wir das Messgerät in das Gewicht in den Masken-Aligner. Anschließend belichten wir es mit Licht.

Das ist hier UV-Licht. Wir laden den Silikonwafer auf den Masken-Aligner und platzieren ihn in den Masken-Aligner. Und diesmal haben wir keine Maske, so dass wir den gesamten Film belichten können.

Lassen Sie uns den Auslöser einschalten und eine Minute Belichtung einstellen, um zu belichten. Nach einer Minute ist das System fertig, wir können dann den Wafer herausnehmen. Und jetzt müssen wir das Backen nach der Belichtung machen.

Wir haben also gerade diesen Wafer belichtet und werden nun Wärme hinzufügen, um die Vernetzungsreaktion für diese erste Beschichtung von SU Eight auszulösen. Wir legen es also eine Minute lang auf eine 65 Grad heiße Platte und dann übertragen wir es für zwei Minuten auf eine 95 Grad heiße Platte. Nach dem zweiminütigen Prozess schalten wir dann die Heizplatte aus und lassen den Wafer wieder auf Raumtemperatur abkühlen, was etwa 30 Minuten dauert.

Also haben wir unsere zweite Schicht SU acht auf diesen Wafer gesponnen. Und jetzt müssen wir das tatsächlich durch die Fotomaske belichten. Dieses Mal werden wir einen UV-Filter verwenden, um das tiefe UV-Licht auszublenden.

Dies ist ein optisches Hoya-Glas, das Sie bekommen können, aber dieses Mal müssen wir die Intensität erneut messen. Wir verwenden also unseren Belichtungsmesser oder den Filter oben, um die Intensität zu messen, die herausgefiltert wurde. Und dann laden wir die Maske in den Masken-Aligner.

Dieser Schalter erzeugt ein Vakuum, das die Maske an Ort und Stelle hält. Wir platzieren es dann in den Masken-Aligner. Wir werden dann den Filter darauf platzieren und dann unseren Wafer einlegen.

Wir wollen sicherstellen, dass es einen guten Kontakt gibt, also heben wir es in Kontakt und beginnen dann mit der Belichtung. Nach der Belichtung nehmen wir unseren Wafer aus dem Masken-Aligner. Jetzt haben wir also Bereiche, die selektiv exponiert wurden. Wir bringen es in den Ofen, auf die heißen Platten, um es nach der Belichtung zu backen.

Wir haben gerade The Po gemacht, das abschließende Backen nach der Belichtung, und jetzt werden wir diesen Wafer entwickeln, damit wir tatsächlich die dreidimensionalen Strukturen erhalten können. Was wir tun werden, ist, dass wir das waschen werden, es in P-G-M-E-A entwickeln, das das unbelichtete SU-Acht wegwäscht. Wir fangen also erst einmal in einer Schale P-G-M-E-A an und setzen die Waffel hier für zwei Minuten unter leichtem Rühren hinein.

Also lasse ich das für zwei Minuten laufen. Also gehen wir zu einer zweiten Schale P-G-M-E-A über. Dadurch wird das gesättigte P-G-M-E-A mit SU-Acht entfernt.

Nach 10 Sekunden bringen wir es in IPA. Dadurch wird das P-G-M-E-A weggespült. Wir legen es hier für 20 Sekunden hinein, wieder mit etwas leichtem Rühren.

Und dann haben wir jetzt die freistehenden Pfostenkonstruktionen. Also werden wir das in Hexan umwandeln, das eine niedrige Oberflächenspannung hat. Wir waschen es fünf Sekunden lang in einem und dann in zwei Hexanen und dann sind wir bereit, es zu föhnen.

Wir haben also gerade den Wafer entwickelt und legen ihn jetzt auf eine heiße Platte und erhöhen die Temperatur langsam auf eins 50. Und was passiert, ist, dass diese höhere Temperatur den SU-Acht weiter vernetzt, um ihn strukturell steifer zu machen, und wir lassen ihn über Nacht auf dieser Heizplatte. Also irgendwo zwischen 14 und 20 Stunden und danach schalten wir die Herdplatte aus und lassen sie wieder auf Raumtemperatur abkühlen.

Was wir also tun müssen, ist, diesen Wafer auf eine kleinere Größe zu zerkleinern. Wir wollen im Grunde diesen Siliziumwafer schneiden und einen kleinen Chip mit genau diesem inneren Muster hier erstellen. Und es wird ungefähr so aussehen wie diese Struktur dort, wo sie Epoxidharz verwenden werden.

Und wir werden diesen Chip auf einen Glasträger kleben, so wie folgt. Und das gibt uns einen strukturellen Rückhalt. Eine Oblate zu würfeln, ist eine Art Kunst, aber was man machen kann, ist, dass man im Grunde einen Diamantritzer verwendet und mit nur einer Kante beginnt.

Und wegen der Kristallebenen setzt man einfach eine kleine Kerbe, die einen Bruch erzeugt hat, den ich dann mit diesem Werkzeug abklopfen kann, wir können das abziehen und wir können dann hier mehr Schnitte machen, bis wir eine kleine Struktur wie diese haben. Und dann setzt man den Siliziumchip nun schnell auf das Glas und montiert ihn an Ort und Stelle. Und das lässt du setzen.

Und wenn Sie fertig sind, haben Sie ein Gerät, das diesem ähnelt. Wir haben also den Silizium-Master auf diesen Glasträger montiert und werden ihn jetzt mit Floy überziehen, was später dazu beitragen wird, diese Struktur von PDMS zu lösen. Wir werden also den Chip in dieses Trockenmittel geben und dann ein paar Tröpfchen dieses Trichloro Siling nehmen und ein paar Tropfen in das Trockenmittel geben.

Wir machen das in der Haube, weil es ein Nebenprodukt von Salzgas ist, das ziemlich hart ist. Fahren Sie fort und schließen Sie den Deckel, befestigen Sie ihn am Vakuum und dann lassen wir ihn aus dem Vakuum sitzen und lassen ihn über Nacht ablagern, um eine schöne Beschichtung über dem gesamten Siliziumwafer zu erhalten. Hallo, ich bin Wesley Ligan.

Ich bin Doktorand im Labor von Christopher Chen. An dieser Stelle hat Nate Ihnen gezeigt, wie Sie ein Silikonmaster für unsere ED-Substrate erstellen können. Bevor wir dieses Werkzeug jedoch zur Messung der zellulären Kontraktilität verwenden können, müssen wir zunächst die starren Photostrukturen mit einem elastomeren Silikonpolymer replizieren.

Unsere erste Aufgabe besteht darin, eine Negativvorlage des Silikonmasters zu generieren, den wir zuvor hergestellt haben. Wir tun dies mit einem Silikonelastomer namens PDMS oder Polymethyl Sloane zu unserem PDMS-Polymer. Wir fügen nun ein Verhältnis von eins zu 10 Härtungsmittel hinzu.

Sobald wir die Lösung abgewogen haben, ist es notwendig, das PDMS-Polymer und das Querleckagemittel gründlich zu mischen. Durch diese Vermischung gelangen natürlich viele Luftblasen in unsere Lösung. An dieser Stelle ist es also notwendig, es abzudecken und im Vakuum zu entgasen.

Sobald das PDMS vollständig entgast ist und alle Blasen an die Oberfläche gestiegen und geplatzt sind, können wir es aus dem Vakuumtrocknen entfernen. Diese Mischung aus PDMS und Vernetzungsmittel können wir nun verwenden, um eine Negativform unseres Siliziummasters zu erzeugen. Und um dies zu tun, verwenden wir eine Kuchenform und platzieren unseren montierten Silikonmaster in der Mitte.

Dann gießen wir die DGAs-Polymerlösung vorsichtig in die Schale über der Oberseite des Siliziumwafers, um zu verhindern, dass sich zusätzliche Blasen bilden. Normalerweise versuchen wir, das Polymer etwa einen Viertelzoll dick zu gießen. Sie können sehen, dass dieser Prozess unweigerlich einige Luftblasen in die Mischung einbringt.

Also stellen wir dieses Gericht jetzt für etwa 30 Minuten beiseite, damit die Blasen an die Oberfläche steigen und platzen können. Wir können sehen, dass sich nach dem Einwirken noch einige Luftblasen in der Oberfläche des PDMS befinden. Da sich diese jedoch an der Oberseite befinden, können wir jetzt einen schnellen Ausbruch von Stickstoff verwenden, um die verbleibenden Blasen zum Platzen zu bringen.

Um die PDMS- und CROSSLINKER-Lösung vollständig zu vernetzen und ein starres negatives Template unseres Siliziummasters zu erzeugen, backen wir es bei 110 Grad Celsius für 20 Minuten. Wir können sehen, dass sich auf dem Silikonsubstrat eine dünne Schicht PDMS befindet. Und bevor wir die beiden auseinander schälen können, ist es notwendig, diese Schicht zuerst wegzuschneiden.

Dann können wir diese oberste Schicht aufpfropfen und vorsichtig vom Silikonsubstrat abziehen. An dieser Stelle können wir das negative Silikonsubstrat, das negative PDMS-Substrat, invertieren und sehr langsam vom Silikonmaster abziehen. Okay, wir tun dies, indem wir ein Ende nach unten halten und das PDMS-Substrat vorsichtig abziehen.

Sie können den vorderen Vorschub sehen, wenn sich das Substrat vom Silikonmaster ablöst. Nachdem wir nun die A-P-D-M-S-Negativform unseres Silikonmasters erstellt haben, können wir diese in vier einzelne Negativformen schneiden, um die endgültigen Pad-Substrate herzustellen. An dieser Stelle ist es wichtig, die Oberseite des negativen Substrats nicht mit einer Pinzette oder Ihren Handschuhen zu berühren, um eine Beschädigung der Oberfläche zu vermeiden.

An dieser Stelle haben wir also vier einzelne negative Templates aus dem Silikonmaster generiert, die aus Vertiefungen mit einem Durchmesser von drei Mikrometern und einer Tiefe von neun Mikrometern bestehen. Um die erhabenen Auslegerflächen zu regenerieren, können wir diese Negativformen mit einem PDI PDMS mittels PDMS erneut begießen. Bevor wir dies jedoch tun, ist es notwendig, diese Negativformen zunächst durch Beschichten mit einem Fluoros nicht klebend zu machen.

Wir tun dies in einer Hundert-Watt-Plasmakammer bei voller Leistung für eine Minute. Nachdem die Kammer den Rückfluss des Plasmas nach unten gepumpt hat, entsteht ein Ionengasfeld, das die PDMS-Oberfläche ätzt und sie haftender an den Fluor-Cy-Lane-Molekülen macht. Nachdem Sie die negativen Formen aus dem Vakuumtrocknen entfernt haben, können Sie hier sehen, dass wir ein Array von drei Mikron x 10 Mikron tiefen Vertiefungen in einer nicht klebenden PDMS-Schicht übrig haben.

Um die vertikalen Ausleger, die wir für die mpad-Substrate verwenden, zu regenerieren, ist es notwendig, diese mit der gleichen PDMS-Mischung wieder abzugießen, und das führt zu einer positiven freistehenden Anordnung von elastomeren Auslegern, die den von uns zuvor hergestellten Siliziummaster identisch widerspiegeln. Der erste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, unsere nicht klebenden Negativformen auf eine Montagevorrichtung zu übertragen, die wir aus PDMS-Streifen und einem Glasobjektträger hergestellt haben. Der Grund für dieses Rigg wird sich im nächsten Schritt herausstellen.

An diesem Punkt können wir einen kleinen Tropfen unserer gleichen 10 bis 1 Mischung von PDMS abscheiden, um bereits entgasende Stoffe auf die Oberseite jeder unserer Negativformen zu übertragen. Es wird nur eine geringe Menge PDMS benötigt, damit es nicht auf den Rand der Negativformen läuft. An dieser Stelle.

Um das PDMS vollständiger über die Oberseite der Formen zu verteilen, können wir eine mit einer Pinzette greifen, sie umdrehen und in Kontakt mit der angrenzenden Form bringen, indem wir sie vorsichtig um das PDMS herum verteilen, um das gesamte Substrat vollständig zu bedecken. Seien Sie in diesem Schritt sehr vorsichtig, um keine weiteren Blasen in die obere PDMS-Lösung einzubringen, die dann mit den anderen beiden Vertiefungen, den anderen zwei Formen, wiederholen kann. Jetzt, da wir eine gleichmäßigere PDMS-Beschichtung auf der Oberseite haben, können wir diese Vorrichtung in ein Vakuum-Trockenmittel legen, um alle Blasen weiter zu entfernen, die in der PDMS-Folie auf unseren Negativformen eingeschlossen sein könnten.

Dieser Vorgang dauert in der Regel etwa 30 Minuten. Während unsere Negativformen entgasen, können wir die 22 x 22 Millimeter großen Glassubstrate reinigen, die zum endgültigen Montageort für die Pads werden. Der erste Schritt dabei ist das Abblasen von Staubpartikeln mit verdichtetem Stickstoff.

Wir setzen die Glasdeckgläser Gasplasma aus, wodurch die Oberfläche vesert wird und sie stärker auf dem PMS haftet, das wir im nächsten Schritt daran kleben werden. Nachdem wir die oberste Schicht des PDMS für etwa 30 Minuten den DGAs erlaubt und die Glasabdeckfolien mit Plasma aktiviert haben, können wir unsere Schablone entfernen und die Oberseite der Glasabdeckscheiben, die dem Gasplasma ausgesetzt war, mit der PDMS-Schicht auf den Negativformen in Kontakt bringen. In der Regel ist es hilfreich, zuerst eine Kante des Glasabdeckschlickers mit dem PDMS in Kontakt zu bringen und dann den Rest des Glasabdeckschlickers in einem SH absetzen zu lassen, so dass sich das PDMS plattenförmig ausbreitet.

Dies trägt dazu bei, Blasen zu reduzieren, die in die PDMS-Folie gelangen. An dieser Stelle können wir mit unserer Pinzette vorsichtig auf die Oberseite des Glasdeckglases drücken, um überschüssiges PDMS herauszudrücken, und den Deckglas gegen das PDMS-Kreuz in der Mitte der Schablone drücken. Dadurch wird verhindert, dass sich der Deckglas während des Aushärtens des PDMS bewegt.

Wir wiederholen dies für die anderen Substrate. An dieser Stelle können wir die gesamte Vorlage in den Ofen schieben und bei 110 Grad Celsius 22 Stunden backen. Nachdem wir die gesamte Baugruppe auf Raumtemperatur abkühlen lassen, können wir unsere Substrate entfernen, sie invertieren und die Negativform vorsichtig vom Glasdeckglas abziehen.

Es ist wichtig, dies langsam und gleichmäßig zu tun, um zu vermeiden, dass die Pfosten zerquetscht oder vom Glassubstrat abgerissen werden. Wir können sehen, dass wir nach dem Abziehen der Negativform eine Reihe von Auslegern übrig haben, die den Silicon Master genau nachahmen, nur dass sie jetzt aus einem flexiblen PDMS-Elastomer bestehen. Okay, an dieser Stelle haben wir Ihnen erklärt, wie wir den Silicon Master unserer Emad-Substrate generieren.

Wir haben dann ein Replica-Molding-Verfahren verwendet, um eine exakte Replik aus A-P-D-M-S-Elastomerpolymer zu erzeugen, so dass die Ausleger jetzt flexibel sind, damit sich die Zelle ausbreiten und zusammenziehen und die Cantilever dabei ablenken kann. Zu diesem Zeitpunkt sind unsere Substrate bereit für die Verarbeitung für die Zellkultur. Nachdem wir nun gesehen haben, wie man Formen herstellt und repliziert, um das EDS herzustellen, werden wir noch ein paar Schritte ausführen, um das EDS funktionsfähig zu machen, damit wir uns selbst kultivieren und anschließend die Zugkräfte analysieren können.

Aber bevor wir das tun, müssen wir drei Dinge tun. Wir müssen die Spitzen der Pfosten an den Zellen kleben lassen. Zweitens müssen wir das PDMS fluoreszierend markieren, um die Visualisierung und Analyse von Post-Deflections zu unterstützen.

Und drittens müssen wir die Seitenwände der Pfosten sowie die Basis der Pfosten nicht an den Zellen klebend machen, so dass die Zugkräfte nur an den Pfostenspitzen ausgeübt werden. Wir werden also in den folgenden Minuten sehen, wie diese Schritte über eine auf Mikrokontaktdruck basierende Strategie ablaufen. Aber zuerst besteht der nächste Schritt darin, überschüssiges P-D-S-P-D-M-S von den eds zu entfernen.

Wie ich bereits erwähnt habe, besteht der erste Schritt darin, das EDS-Substrat zu nehmen, das West Ihnen gerade gezeigt hat, wie man sie erzeugt und abschneidet. Das überschüssige PDMS, das durch das Aushärten der Glasabdeckung entstanden ist, gleitet gegen die Negativform und die Verwendung einer scharfen Rasierklingenverkleidung. Das überschüssige PDMS machst du, indem du die Rasierklinge senkrecht nach unten auf das Substrat am Rand der Säulen legst und dann wegkratzst.

Und Sie können den Deckglas mit einem Finger an Ort und Stelle halten, damit sich der Deckglas nicht bewegt. Am Ende haben wir also ein M-Pad-Substrat, das von Schmutz gereinigt wurde und daher leicht zugänglich ist. Für den nächsten Schritt müssen wir also Mikrokontakt herstellen und die MPAs drucken, um die Spitzen der Pfosten zu kleben

Um dies zu tun, müssen wir zuerst Stempel generieren, und dieser Vorgang ist sehr einfach. Wir mischen einfach PDMS ein, anstatt ein Verhältnis von 10 zu eins, ein Verhältnis von eins zu 30 zu eins. Wir gießen eine Petrischale ein, so dass die PDMS-Höhe etwa einen Zentimeter beträgt.

Lassen Sie es entgasen. Das heißt, die Blasen an die Oberseite des PDMS aufsteigen lassen und die Vernetzungsreaktion im Ofen bei 60 Grad eine Stunde lang aushärten lassen, nachdem ich die Form aus dem Ofen genommen und abkühlen gelassen habe, bin ich jetzt bereit, die Stempel auszuschneiden. Also nochmal, mit der gleichen Art von Rasierklinge, einfach schneiden, indem man senkrecht nach unten in das PDMS drückt, bis man den Boden der Petrischale berührt.

Nun ist die Ausrichtung des Stempels etwas, auf das wir achten wollen. Die Stempeloberfläche wird die Seite des PDMS sein, die gegen den Boden der Petrischale gegossen wurde, damit sie flach bleibt. In diesem großen PDMS-Quadrat, das ich ausgeschnitten habe, ist die Stempeloberfläche nun nach oben gerichtet.

Nun, dieser Stempel ist viel größer als die M-Pads, also werde ich ihn wieder auf die Größe eines einzelnen M-Pads zuschneiden, indem ich ihn mit der Rasierklinge ausschneide, da es sehr schwierig ist, die richtige Ausrichtung des Stempels mit dem Auge zu erkennen, ich werde eine kleine Kerbe in die Rückseite des Stempels einfügen, die die Nicht-Gesichtsseite ist, genau so. Und ich kann dann den Stempel von der größeren Platte entfernen. Und jetzt habe ich den A-P-D-M-S Stempel für den nächsten Schritt.

Wir wollen die PDMS-Stempel reinigen. Da es sehr gut möglich ist, dass sich beim Schneiden Staub aus der Atmosphäre auf den PDMS-Stempeln abgesetzt hat. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem wir die gewünschte Anzahl an PDMS-Stempeln in diese Kristallisationsschale geben und die Kristallisationsschalenschale mit 100%Ethanol füllen.

Füge also einfach so viel Ethanol hinzu, dass die Vorderseite der Stempel bedeckt ist, aber die genaue Menge an Ethanol ist nicht wichtig. Und dann legen Sie die Kristallisationsscheibe in einen Ator und beschallen Sie die Stempel fünf Minuten lang. Nachdem die fünf Minuten abgelaufen sind, werden wir die Sterilisation der Stempel abschließen und den Rest des Mikrokontaktdrucks durchführen, d. h. die Funktionalisierung der M-Pads in einer sterilen Gewebekulturhaube.

Jetzt befinden wir uns also in der Gewebekulturhaube, wo wir die Sterilisation der Stempel abschließen können. Dazu nehmen wir die Stempel aus der Kristallisationsschale, tauchen sie in eine Schale voller Ethanol, um alle verbleibenden Rückstände abzuspülen, und tauchen sie schließlich in eine Schale mit Wasser, um das Ethanol abzuspülen. Anschließend trocknen wir die Stempel mit einem Stickstoffstrahl, bis keine Tropfen mehr sichtbar sind.

Im nächsten Schritt müssen wir die Stempel mit einer Proteinlösung einfärben. Die Proteinlösung, die wir verwenden, besteht aus 50 Mikrogramm Fibrin pro Mil in DEI-Wasser. Nehmen Sie einfach einen Teil der Proteinlösung in die Pipette und geben Sie Tropfen der Proteinlösung auf die Stempelfläche.

Sie möchten dies tun, indem Sie kleine Tröpfchen am Rand der Stempelfläche platzieren. Wiederholen Sie dies zunächst für alle Stempel, die Sie verwenden werden, und ich hätte dies im Voraus tun sollen. Der nächste Schritt, nachdem Sie Punkte an den Rändern aller Stempel platziert haben, besteht darin, diese Tröpfchen zu verbinden und die Proteinlösung auf die Stempelfläche zu füllen.

Der Grund, warum wir dies getan haben, ist, dass die Proteinlösung in den Tröpfchen und SOS unter den Tröpfchen die Stempeloberfläche hydrophil macht, was die Ausbreitung des extrazellulären Matrixproteins erleichtert. Wiederholen Sie dies also noch einmal für alle Stempel, die Sie jetzt verwenden, da wir die Proteinlösung auf die Vorderseite der Stempel verteilen, der letzte Schritt beim Einfärben der Stempel besteht darin, sicherzustellen, dass die Ränder bedeckt sind. Dazu winkeln wir einfach eine Pipette an und führen sie entlang der Stempelfläche, so dass Sie sowohl die Ecke des PDMS-Stempels als auch die Proteinlösung berühren.

Wiederholen Sie dies erneut für alle Kanten aller Stempel, die Sie einfärben. Jetzt, da wir mit dem Einfärben der Stempel fertig sind, setzen wir diese Stempel und lassen die Stempel eine Stunde lang in der Gewebekulturhaube, um die vollständige Absorption des Proteins auf der Stempeloberfläche zu erleichtern. Nachdem wir nun eine Stunde darauf gewartet haben, dass die Proteine in ihrem Speicher sind und auf die Stempeloberfläche aufgenommen werden, ist es an der Zeit, sie mit Wasser abzuspülen und mit Stickstoff zu föhnen.

Dazu nehmen wir steriles Wasser und gießen das sterile Wasser in die Schale mit den Stempeln. Achten Sie darauf, dass Sie das Wasser nicht direkt auf die Stempelfläche gießen, und Sie können bei Bedarf eine Pipette verwenden. Die genaue Menge an Wasser, die du hattest, ist nicht wichtig, solange du den Wasserspiegel über die Proteinlösung bringst.

Nehmen Sie danach mit einer sterilen Pinzette einen Stempel, tauchen Sie ihn in eine neue Schüssel mit Wasser und blasen Sie ihn vorsichtig mit Stickstoff trocken. Auch hier weißt du, dass es trocken ist, wenn du siehst, wenn du keine Tröpfchen der Proteinlösung mehr auf dem Stempel siehst. Wiederholen Sie dies für alle Stempel, die Sie nacheinander bearbeiten.

Nachdem wir die Stempel trocken gespült haben, ist es an der Zeit, die mpad-Substrate zu aktivieren, indem wir sie mit UV-Ozon behandeln. Sieben Minuten lang entferne ich den Deckel der Petrischale von oben, von der Oberseite der Schale. Weil Sie, weil Styropor UV-absorbierend ist, stelle ich die Schale dann in das UV-Ozon-Behandler, schließe die Schublade, stelle die Zeit auf sieben Minuten ein und lasse sie laufen.

Jetzt sind wir also wieder in der Gewebekulturhaube und es ist an der Zeit, die mpad-Substrate zu stempeln, die gerade mit UV-Ozon behandelt wurden. Heben Sie dazu unsere gespülten und getrockneten Stempel mit einer Pinzette an. Sie können die Stempel an den Seiten anfassen, aber berühren Sie nicht die Vorderseite des Stempels.

Sie möchten den Stempel in der Pinzette so einstellen, dass die Proteinseite zugänglich ist. Dann invertierst du die Pinzette, wobei du im Hinterkopf behältst, dass die Proteinseite nach unten gerichtet ist, und bringst den Stempel langsam in Kontakt mit dem EDS. Die Stempel von ein bis 30 sind ziemlich klebrig, so dass du vielleicht eine zweite Pinzette verwenden musst, um den Stempel von der Pinzette zu lösen.

Sie können den Stempel von einer Höhe von etwa zwei Millimetern bis zu etwa acht Millimetern auf die Emeds fallen lassen. Kippen Sie dann die Schale der Emeds nach oben und drücken Sie sie mit einer Pinzette leicht nach unten, um einen Kontakt zwischen dem Stempel und dem Eds herzustellen. Sie werden wissen, wann der Kontakt auf zwei Arten hergestellt wird.

Die erste besteht darin, die ED-Oberfläche durch die Seite des Stempels zu betrachten. Das mag mit der Kamera schwer zu erkennen sein, aber mit dem Auge kann ich deutlich sehen, dass der Stempel mit der Oberfläche in Kontakt kommt, indem ich durch die Seite des Stempels auf die Oberfläche schaue. Die zweite Möglichkeit, den Kontakt mit dem p zu gewährleisten, besteht darin, die Petrischale mit aufgesetztem Deckel aus der Gewebekulturhaube zu nehmen und sie unter einem inversen Mikroskop zu betrachten.

Durch die Visualisierung von Interferenzmustern mit dem Mikroskop sollten Sie in der Lage sein zu erkennen, wann, ob und wann der Stempel mit dem EDS in Kontakt kommt. Sobald Sie den Kontakt festgestellt haben, muss der Stempel nur noch einige Sekunden lang mit diesem in Kontakt mit dem ed-Substrat bleiben. Jetzt ist es also an der Zeit, den Stempel zu entfernen.

Falten Sie dazu die Eds mit einer Pinzette nach unten und ziehen Sie den Stempel in einer sanften Bewegung ab. Achten Sie darauf, im Auge zu behalten, welche Eds Sie gestempelt haben und welche Stempel Sie bereits verwendet haben. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal pro EMPAs für jedes Substrat, das Sie verwenden möchten.

Nachdem wir die EMPA gestempelt haben, besteht der nächste Schritt darin, sie zu sterilisieren und dann in einem lipophilen Farbstoff namens Dye Eye zu inkubieren. Dai ist ein lipophiles Molekül, das fluoreszenzmarkiert ist, so dass es im Laufe der Zeit in das PDMS diffundiert, was es uns ermöglicht, die Nachablenkungen unter dem Mikroskop zu visualisieren. Was ich also tun werde, ist, jedes einzelne Empa-Substrat einzeln zu nehmen und es in 100% Ethanol, 70% Ethanol, DI Wasser, DI Wasser, DI Wasser, DI Wasser zu tauchen.

Und schließlich eine Dii-Lösung von fünf Mikrogramm pro Mil. Die DII-Lösung ist fluoreszierend, d.h. um die Exposition gegenüber Umgebungslicht und das Ausbleichen zu minimieren, decken wir die Schalen mit Aluminiumfolie ab, während sie eine Stunde lang in der Gewebekulturhaube inkubieren. Nachdem wir nun eine Stunde gewartet haben, bis die EM-Pads in der DAI-Lösung inkubiert sind, können wir die Aluminiumfolie entfernen und die DAI-Lösung ausspülen.

Wir spülen es aus, indem wir drei aufeinanderfolgende Immersionen in sterilisiertes Wasser durchführen und schließlich in eine Lösung von 0,2 % F1 27 eintauchen. Das sind 0,2 % Gewicht pro Volumen Bei allen Immersionsschritten ist es wichtig, die Zeit, in der die EM-Pads der Luft ausgesetzt sind, zu minimieren. Dadurch soll eine Beschädigung der ED-Substrate vermieden und insbesondere verhindert werden, dass zwei Pfosten aufeinander fallen.

Das 0,2%onische F1 27 ist ein Tri-Block-Copolymer, das aus hydrophilen und hydrophoben Domänen besteht. Es ist bekannt, dass die hydrophile Domäne der Proteinabsorption und damit der Zelladhäsion widersteht, während die hydrophobe Domäne an das temperamentvolle PDMS bindet. Wenn PDMS also in F1 27 getränkt ist, bindet das F1 27 an das PDMS und stößt die Zelladhäsion ab.

Nach einer Stunde Inkubation in chronischem F1 27 in einer mit Aluminiumfolie bedeckten Petrischale können wir das F1 27 durch sequentielles Eintauchen in steriles Wasser, steriles Wasser und PBS ausspülen. Nach dem Eintauchen in PBS und dem Ausspülen des Produkts F1 27 können wir die Substrate des eds in eine Zellkulturlösung der Wahl tauchen. Die Zellkulturlösung, in die ich die EMPAs gerade eingetaucht habe, kann Serum und/oder andere Wachstumsfaktoren und/oder Nahrungsergänzungsmittel wie Penicillin und Streptomycin enthalten.

Alle diese Inhaltsstoffe sind vollständig mit den EMPA-Behandlungen kompatibel. Der nächste Schritt, nachdem die Eds in die Zellkulturlösung eingetaucht wurden, besteht darin, die Zellen der Wahl auf die Eds zu säen. Für diesen speziellen Versuchsaufbau werde ich Rinder-Lungenaortenadothelzellen in drei verschiedene Schalen säen.

Der Grund, warum ich drei verschiedene Schalen verwende, ist, dass ich zwei der Schalen mit bekannten Taktilitätshemmern behandeln werde, um die Durchbiegungen der Pfosten zu hemmen, da wir zu einem späteren Zeitpunkt testen können. Um die Zellen zu säen, nehme ich einfach meine Zellsuspension, ziehe die entsprechende Menge in die Pipette auf und pipettiere tropfenweise in jede Schale. Ich füge so viele Zellen hinzu, dass die Zellen beim Assay zur Messung der Zugkräfte als einzellige Zellen auf dem eds existieren.

Die Menge, die Sie hinzufügen, hängt sowohl von der Ausbreitungsfläche als auch von der Wachstumsrate Ihrer speziellen Zellen ab. In der Regel säen wir zwischen 1500 und 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter Substrat. Nachdem Sie mit dem Aussäen der Zellen oder dem Bearbeiten der Zellsuspension fertig sind, schütteln Sie die Kultur tropfenweise mehrmals in orthogonaler Richtung hin und her, um die Zellsuspension in die Kulturschale zu mischen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Substrate, die Sie verwenden. Unmittelbar nach der Aussaat der Zellen legen Sie sie in einen 37-Grad-Inkubator mit einem geeigneten Kohlendioxidgehalt, um den pH-Wert und das Zellkulturmedium zu puffern. Zwei Stunden, etwa zwei Stunden nach dem Aussäen der Zellen, ist es angebracht, die Zellen zu spülen, indem die Substrate von einer Schale des Mediums auf eine frische Schale desselben Zellkulturmediums übertragen werden.

Der Grund für diese Spülung ist, dass die meisten Zellen mit der Ausbreitung begonnen haben und nach zwei Stunden fast ihren endgültigen Ausbreitungsbereich erreicht haben. Durch das Spülen der Zelle, der Substrate, entfernen Sie alle schwimmenden Zellen aus dem Zellkulturmedium. Auf diese Weise werden nur Zellen, die sich an das EDS anheftet haben und mit dem Ausbreitungsprozess beginnen, im Endpunkt-Assay für Zugkräfte angezeigt.

Ein Assay, den wir mit Zellen durchführen können, die auf MPAs kultiviert wurden, ist die Zeitrafferbildgebung, um die Dynamik der zellulären Kontraktilität quantitativ zu untersuchen. Insbesondere ist die Dynamik der zellulären Kontraktilität als Reaktion auf lösliche Faktoren interessant. Es ist bekannt, dass lösliche Faktoren wie biologische Verbindungen und synthetische Verbindungen die zelluläre Kontraktilität erhöhen, verringern oder unbekannte Auswirkungen auf die zelluläre Kontraktilität haben.

Für dieses Lebendzellexperiment werden wir dieses inverse Epi-Fluoreszenzmikroskop verwenden. Auf dem Mikroskoptisch habe ich eine kleine Inkubatorbox, die an einen Wärmeregler angeschlossen wurde, um die Temperatur mit 5 % CO2 auf 37 Grad Celsius zu halten. Wir werden mit einem 60-fachen APO-Objektiv mit hoher Vergrößerung fotografieren.

Jetzt bereiten wir das Impact-Substrat für die Bildgebung vor. Das 60-fache Objektiv, das wir für die Bildgebung verwenden, hat einen Arbeitsabstand von 200 Mikrometern, was viel dünner ist als die Dicke der Gewebekulturschale, in der wir die Zellen früher ausgesät haben. Deshalb können wir nicht, wir können keine Zellen auf den Implantaten in der Gewebekulturschale abbilden.

Um dieses Problem zu umgehen, verwenden wir diese Glasbodenschalen. Ich werde nun das Substrat kopfüber in die Glasbodenschale übertragen, so dass die Zellen und die Spitzen der Stifte an der Schnittstelle der Glasbodenschale liegen. Wenn es auf das Mikroskop gelegt wird, beträgt der Arbeitsabstand zwischen den Zellen und dem Objektiv weniger als 200 Mikrometer.

Jetzt sind wir bereit, dies für die Bildgebung auf ein Mikroskop zu legen. Ich öffne nun die Inkubatorkammer für lebende Zellen, lege die Probe hinein und setze den Deckel der Inkubatorkammer wieder auf. An dieser Stelle werde ich das Substrat nach einer geeigneten Zelle absuchen.

Zum Bild. Der effizienteste Weg, dies zu tun, besteht darin, ein 10-fach-Objektiv der ersten Phase zu verwenden, das es mir ermöglicht, ein breiteres Feld des Substrats zu sehen und eine Zelle schneller zu finden. Mein Kriterium für eine gute Zelle bezieht sich auf eine einzelne Zelle.

Es sollte keine benachbarten Zellen berühren, und es sollte auch ungefähr durchschnittlich groß sein im Vergleich zu allen anderen Zellen auf dem Substrat, ich fand eine geeignete Zelle, die ich mir ansehen konnte. Als nächstes schalte ich das Objektiv auf 60 x um, um die Zelle mit hoher Vergrößerung zu betrachten. Um das zu erreichen, defokussieren wir das Ziel, d.h. es geht darum, die Bühne während der Drehung nicht zu stoßen.

Während des Drehens des Revolvers öffnen Sie die Kammer, drehen Sie teilweise das 60-fach-Objektivinterview, das 60 x 60-x-Objektiv ist eine Öl-Immersionslinse, daher müssen wir einen Tropfen Immersionsöl auf die Objektivlinse geben. Jetzt werden wir den Rasen fertig drehen, um den 60 x in Position zu bringen. Wir werden die Inkubatorkammer schließen und das Ziel neu fokussieren, um die Zelle wieder in den Fokus zu rücken.

Sobald ich die Position und den Fokus der Zelle fein abgestimmt habe, wechsle ich zur CCD-Kamera, um eine Vorschau der Zelle auf dem Computerbildschirm anzuzeigen und dann die Zeitrafferaufnahme zu starten. Für dieses Experiment werde ich sowohl Phasen- als auch Fluoreszenzbilder in einem Intervall von einer Minute sammeln, also hat die Zeitrafferbildgebung begonnen und ich lasse sie 10 Minuten oder 10 Bilder laufen, und dass zu diesem Zeitpunkt 10 Minuten Serum hinzufügen, ist jetzt vergangen. Zu diesem Zeitpunkt werde ich die Kammer öffnen und Serum in die Schale geben, um die Kontraktilität in der Zelle zu stimulieren.

Der Timer läuft noch, also muss ich schnell sein. Jetzt werden wir die Zelle 30 Minuten lang abbilden, um Veränderungen der Kontraktilität zu verfolgen. Nachdem wir die Zeitrafferaufnahme abgeschlossen haben, können die Bilder zu einem gezeigten Film sequenziert werden. Hier sind zwei Filme mit den Phasen- und Fluoreszenzbildern.

Auf der linken Seite ist ein Phasenfilm von a zu sehen, von einer meist transparenten, schwarz umrandeten Zelle. Die Zelle erstreckt sich über die Spitzen von 20 Pfosten, bei denen es sich um kreisförmige Strukturen handelt, die in einem rechteckigen Gitter angeordnet sind. Auf der rechten Seite ist ein fluoreszierender Film der gleichen Zelle zu sehen, aber nur die Pfosten sind zu sehen.

Wenn ich diese Filme abspiele, werden Sie sehen, dass die an der Zelle befestigten Pfosten anfangs schwach sind, abgelenkt sind und nur sehr wenig vom rechteckigen Gitter abweichen. Gegen Mitte des Films habe ich den Medien Serum hinzugefügt. Das Serum regt die Zelle an, die Kontraktilität zu erhöhen.

Wenn die Zelle größere Zugkräfte auf die darunter liegenden Pfosten ausübt, beginnen die Pfosten entlang des Umfangs der Zelle, nach innen abzubiegen. Im fluoreszierenden Film sehen Sie nun, dass Pfosten erheblich von ihrer Position im rechteckigen Gitter abweichen. Wie ich später beschreiben werde, kann die Verschiebung dieser Pfostenpositionen in diesen Bildern verwendet werden, um die Zugkräfte dieser Zelle zu analysieren.

Zuvor haben wir gesehen, wie wir die mpad-Substrate erzeugen und wie wir sie funktionalisieren, um Zellen zu kultivieren. Nun haben Sie sicher bemerkt, dass ich die fertigen mpad-Substrate in drei verschiedene Zellkulturschalen gegeben habe. Die Zellen sind über Nacht gewachsen, und jetzt werde ich jede einzelne Zellkulturschale mit einem anderen löslichen Wirkstoff behandeln, der die Kontraktilität auf bekannte Weise moduliert.

Wir können dann quantitativ die Zugkräfte messen, die sich nach dem Fixieren der Zellen nach 30 Minuten ergeben. Nach der Zugabe der löslichen Faktoren 30 Minuten nach der Zugabe der Kontraktilitätshemmer ist es nun an der Zeit, die Zellen mit Paraformaldehyd zu fixieren, um den aktuellen Zustand der Zugkräfte zu sichern. Um dies zu erreichen, ist es wichtig, Paraformaldehyd zu verwenden, das Calcium und Magnesium enthält, und wir verwenden Paraformaldehyd in einem Volumenprozentsatz von 3,7 %Die Methode zum Eintauchen der Substrate in Paraformaldehyd ist die gleiche wie die Methode zum Eintauchen der Substrate in dieses, in die verschiedenen RINs während der Funktionalisierung.

Das heißt, es ist wichtig, die Substrate nicht austrocknen zu lassen, da dies zu einem Nachkollaps führen kann. Nachdem ich die Substrate übertragen habe, lasse ich sie 20 Minuten lang in Paraformaldehyd inkubieren. Nach Ablauf der 20 Minuten entfernen wir nun die Substrate vom Paraform-Aldehyd und nachdem die Zellen fixiert sind, können wir diese Proben für die Standard-Immunfärbung verarbeiten.

Dazu legen wir die Substrate mit der Vorderseite nach oben auf den Parameter und pipettieren auf so viel PBS, dass das Substrat bedeckt ist, und halten es unter dem PBS. Dann spülen wir ein Substrat dreimal mit PBS aus, um eventuell in der Kultur verbleibenden Paraformaldehyd zu entfernen. Nachdem wir das Substrat dreimal mit PBS gespült haben, können wir das Substrat für die nachgeschaltete Immunfärbung übertragen.

Wir tun dies, indem wir das Substrat mit einer Pinzette anfassen und im ersten Schritt der Immunfärbung invertieren, und das ist ein Permeationsmittel. In diesem Fall verwenden wir 0,2 %Triton X in PBS. Der Benutzer kann jedoch den für seine Anforderungen am besten geeigneten Aktivierungsagenten verwenden.

Wir wiederholen dies für alle unsere Substrate und so behandeln wir die Substrate während des Immunfärbungsprozesses. Nach der Immunfärbung werden die Substrate auf einen Standard-Objektträger von einem Zoll x drei Zoll montiert, der dann auf jedem Epi-Fluoreszenzmikroskop bearbeitet werden kann, sei es invertiert oder aufrecht. Durch die Bearbeitung der Proben an einem konfokalen Mikroskop können wir uns auf die Unterseite der Pfosten konzentrieren, um die unabgelenkte, d. h. Nullpositionen, zu erhalten.

Wir können dann bis zu den Spitzen der Pfosten fokussieren, ein weiteres Bild der Pfosten aufnehmen, und indem wir das obere mit dem unteren Bild vergleichen, können wir die Auslenkungen der Pfosten messen und die Zugkräfte der Zellen berechnen, die die Zellen erzeugt haben, um solche Ablenkungen zu erzeugen. Indem wir diesen Prozess für viele verschiedene Zellen unter verschiedenen Bedingungen durchführen, können wir dann die Zugkräfte vergleichen, die unter den verschiedenen Bedingungen erzeugt werden. Nachdem wir nun Bilder von lebenden und fixierten Zellen gesammelt haben, besteht die nächste Aufgabe darin, die Ablenkung zu messen, die Zugkräfte in den Zellen zu messen.

Um dies zu tun, um dies zu tun, haben wir ein Computerprogramm in Matlab geschrieben. Dies sind die drei Bilder, die wir in dieser Analyse verwenden werden. Das erste Bild ist ein Phasenbild der Zelle.

Es ist hilfreich, um den Standort der Zelle zu identifizieren. Das zweite Bild ist ein fluoreszierendes Bild der Spitzen der Pfosten. Wir verwenden dieses Bild, um die Positionen der, der Pfosten an ihrer Spitze zu lokalisieren.

Wie Sie sehen können, sind einige dieser Pfosten abgelenkt und weichen von dem rechteckigen Gitter ab, in dem sich die meisten Pfosten befinden, wie z. B. bei diesem Pfosten. Und dieser Beitrag. Das dritte Bild, das wir verwenden werden, ist das Basisbild, das die Position der Pfosten an a, an der, an einer Brennebene erfasst, die durch die, durch ihre Basis verläuft.

Auf dieser Höhe sollten sich sowohl die ausgelenkten als auch die nicht ausgelenkten Pfosten in ihrer Ruhestellung befinden, un- und nicht ausgelenkt. In dem rechteckigen Gitter können Sie sehen, dass sich die Pfosten, die im zweiten Bild an ihrer Basis abgelenkt wurden, in ihrer FL-Position befinden. Dieses Bild wird verwendet, um die Position des Beitrags zu finden, es ist, es ist unter der reflektierten Position.

Als nächstes laden wir das MATLAB-Programm, das uns auffordert, diese drei Bilder zu laden. Geben Sie der Datei einen Namen. Sie sehen das Phasenbild.

Wir zeichnen ein Kästchen um die Stelle, an der sich die Zelle befindet, damit das Programm weiß, welche Beiträge analysiert werden müssen. Das Programm führt dann die Intensität, Schwellenwertbestimmung und Aktivierung des zugeschnittenen Bildes durch, um die OID-Koordinaten der Beiträge zu bestimmen. Auf der linken Seite befinden sich formatierte Bilder von Beiträgen aus dem oberen Bild, während auf der rechten Seite formatierte Bilder derselben Beiträge aus dem Basisbild zu sehen sind.

Nach dem Abrufen der Pfosten, der OID-Koordinaten, kann das Programm dann die Verschiebungsvektoren zwischen der Spitze und der Basis jedes Pfostens bestimmen. Diese Pfostenverschiebungsvektoren können in Kraftvektoren umgewandelt werden, indem sie mit der Federkonstante des Pfostens multipliziert werden. Wir können diese zellulären Kräfte auf verschiedene Weise analysieren, z. B. als durchschnittliche Kraft pro Zelle oder als durchschnittliche Kraft pro Pfosten.

Ein nützliches Ergebnis ist ein Köcherdiagramm, aus dem wir die räumliche Verteilung der Kräfte visualisieren können. Dies ist die Zelle, die wir gerade analysiert haben, und Sie können sehen, dass ich gelbe Pfeile über die Pfosten gelegt habe, die mit der Größe der Kraft korrelieren und in die Richtung der Kraft zeigen. Durch die Wiederholung dieses Bildanalyseprozesses für Sequenzbilder, wie sie in unserem Zeitrafferfilm benötigt werden, können wir eine zeitliche Sequenz erzeugen.

Hier ist ein Film von der Zelle, die wir mit Serum stimuliert hatten. Wie Sie sehen können, erhöhte die Zelle, genau wie das Serum hinzugefügt wurde, die Kontraktilität und lenkte die Pfosten noch mehr ab. Darüber hinaus können wir die Kräfte für eine größere Anzahl von Zellen quantifizieren, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt und dann fixiert gefärbt wurden, wie am Beispiel dieser Köcherdiagramme gezeigt, die eine mit einer Kontrollsubstanz behandelte Zelle im Vergleich zu Zellen zeigen, die mit Kontraktilitätsinhibitoren behandelt wurden.

So wie Sie können. Wie Sie sehen können, sind die Kraftvektoren auf der, in der Zelle im Kontrollfall größer als die Kraftvektoren, die in der Länge größer sind. In den beiden Fällen, in denen die Kontraktilitätsinhibitoren verwendet wurden, haben wir hier eine Menge Materialmaterial behandelt, um den Weg des Substrats von der Mikrofabrikation zur Probenvorbereitung, zum Experimentieren und zur Analyse zu beschreiben und die vielseitige Vielseitigkeit dieser Substrate zu demonstrieren.

Wir haben zwei verschiedene Assays beschrieben, die Bildgebung von lebenden Zellen und den Assay mit festen Proben, und wir haben die Zellen analysiert, die aus diesen beiden Assays gewonnen wurden, und wir haben Köcherdiagramme und Köcherfilme gezeigt. Mit diesem leistungsstarken Werkzeug kann man eine Vielzahl von räumlichen und zeitlichen Analysen der Zellkontraktilität durchführen. Wie Sie gesehen haben, stützte sich diese Methode auf viele verschiedene Disziplinen, darunter solche aus der Mikrofabrikation, der grundlegenden Zellbiologie, der Oberflächenwissenschaft, der Bildanalyse und -verarbeitung und vielen anderen.

Und gerade weil die Methode auf mehreren verschiedenen technischen Techniken basiert, können die Parameter wie die Geometrie der Säulen, die induzierten löslichen Faktoren und die Methoden zur Analyse der Stützenablenkung je nach den Bedürfnissen des Benutzers angepasst werden. Wir hoffen, dass die visuelle Demonstration dieser Methode, die wir in den letzten 20, 30 Minuten skizziert haben, als Ausgangspunkt für weitere und tiefergehende Analysen über die Regulation, die funktionellen Konsequenzen und die Erzeugung zellulärer Anziehungskräfte verwendet werden kann.