Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine hohe Transfektionseffizienz in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen durch optimierte Transfektions- und Kerntransfektionsprotokolle zu erreichen. Dies wird erreicht, indem zunächst kulturgefäßfreie Kulturen humaner induzierter pluripotenter Stammzellen etabliert werden. Für die Transfektion werden die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen über Nacht auf Gelt, TRX oder Matrigel gelegt.

Während für die Nukleofektion kleine Zellklumpen durch Trypsin gewonnen werden, wird ein Gemisch aus Plasmid-DNA und Gen-Juice-Transfektionsreagenz zu den angesiedelten Zellen hinzugefügt, anschließend wird die Platte zentrifugiert und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die humane iPS-Zellsuspension wird in einem Nukleofektionsgerät nukleofiziert, die Zellen werden in meth-konditioniertem Medium resuspendiert und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine effiziente genetische Modifikation durch hohe Transfektionseffizienz in humanen iPS-Zellen belegen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der zuvor beschriebenen Transfektions-Elektroporation und nuklearen Affektionsmethoden liegt darin, dass in unserem Labor routinemäßig eine hohe Transfektionseffizienz in humanen iPS-Zellen mit konsistenten Ergebnissen erzielt werden kann. Unsere Protokolle gewährleisten zudem einen minimalen Zelltod nach genetischer Modifikation. Folglich ermöglichen unsere Protokolle eine schnelle und großskalige Erzeugung transgener humaner iPS-Zelllinien. Bevor humane induzierte pluripotente Stammzellen an kultivierbedingte Freikultur angepasst werden, bereiten Sie Gelt-TRX-beschichtete Schalen vor.

Als Nächstes massieren Sie die zuvor auf Fütterungszellen kultivierten humanen IPCs mit einem Milliliter Accutane pro Vertiefung und inkubieren bei 37 Grad Celsius für eine Minute, bis die meisten Zellen beginnen, sich zu lösen. Geben Sie dann 10 bis 15 Glasperlen zu den Zellen hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig. Anschließend zwei Milliliter Knockout D-M-E-M-F 12 hinzufügen und vorsichtig pipettieren. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 800 U/min. Aspirieren Sie das Überstand, wobei das menschliche iPS-Zellpellet intakt bleibt. Schlagen Sie das Röhrchen vorsichtig an, um das Zellpellet sanft zu lösen.

Reese, suspendieren Sie das humane IPSC-Pellet in einem geeigneten Volumen STEM pro-Medium und verteilen Sie es auf die Vertiefungen einer mit Gel TRE beschichteten Platte. Je nach Proliferationsrate können humane IPCs im Spaltverhältnis von eins zu zwei bis eins zu sechs weitergegeben werden. Stellen Sie die Platte vorsichtig in einen 5 % CO₂, 37 °C-Brutschrank und schwenken Sie die Platte sanft, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen sicherzustellen.

Füttern Sie die Zellen täglich. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, sind sie erneut zur Passage auf ein neues Gel vorbereitet. Ein Rex-beschichteter Kolben mit einer Aufteilungsrate von eins zu zwei sollte am Tag der Transfektion eine Konfluenz von etwa 40 bis 50 % aufweisen und kleine Kolonien enthalten, die gleichmäßig auf dem gelbeschichteten Kolben verteilt sind, um eine optimale Transfektionseffizienz zu erzielen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie 100 Mikroliter Knockout-Medium in einem sterilen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen vor. Geben Sie 27 Mikroliter Gene-Juice-Transfektionsreagenz hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie es fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie anschließend vier Mikrogramm Plasmid-DNA hinzu.

Die Wahl des Plasmids ist entscheidend für eine optimale Transfektionseffizienz. Das hier verwendete Plasmid enthält ein durch einen CAG-Promotor angetriebenes verbessertes grün fluoreszierendes Protein, ein starker Promotor, der in humanen IPCs transkriptionell aktiv ist. Inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Nach 15 Minuten das Gene-Juice-DNA-Gemisch zu den Zellen hinzufügen und die Platte schwenken. Die Platte fünf Minuten bei 1.200 U/min zentrifugieren, um den Kontakt des Transfektionsgemischs mit den humanen IPCs in der Vertiefung zu erhöhen. Die Zellen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Überwachen Sie die Transfektionseffizienz am Tag der nukleären Behandlung. Behandeln Sie humane IPCs vorab mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius, während die humanen iPS-Zellen vorbehandelt werden. Bereiten Sie 82 Mikroliter Lösung für nukleäre Effektoren aus menschlichen Stammzellen in einem sterilen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen vor. Geben Sie 80 Mikroliter hinzu.

Ergänzen Sie ein Supplement und mischen Sie es sorgfältig durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Erwärmen Sie zuvor vorbereitete, mit Futterzellen konditionierte Medien und 0,25 % Tripsin in EDTA auf 37 Grad Celsius unter dem Abzug.

Beschriften Sie vorab ein steriles 15-Milliliter-Konischgefäß. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus der menschlichen iPSC-Kultur, die kernübertragen werden soll, und waschen Sie die Zellen sanft mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Aspirieren Sie den PBS und geben Sie Trypsin hinzu; inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.

Für eine erfolgreiche Nukleotid-Transfektion ist es entscheidend, die Zellen nicht mit Trypsin in Einzelzellen zu lösen. Stattdessen sollten die Zellen durch Pipettieren in kleine Zellhaufen mit zwei bis drei Zellen aufgetrennt werden. Vorsichtig die Zellen mit einer P-1000-Pipettenspitze in kleine Zellhaufen mit zwei bis drei Zellen aufbrechen.

Spülen Sie den Boden des Wells durch mehrfaches Pipettieren, um sicherzustellen, dass alle menschlichen IPCs vollständig abgelöst sind. Überführen Sie dann die Zellsuspension in das beschriftete 15-Milliliter-Kegelrohr. Fügen Sie anschließend neun Milliliter Kulturmedium für embryonale Fibroblasten der Maus hinzu.

Um die Trypsin-Aktivität zu stoppen, zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 U/min für drei Minuten. Aspirieren Sie vorsichtig das Überstandsgemisch, wobei das Zellpellet intakt bleiben soll. Suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern einer vorher erwärmten humanen Stammzell-Nukleareffektorlösung.

Unter Verwendung einer 1-milliliter-Pipettenspitze werden die Zellen in ein Nuklear-Effectoren-Vial überführt. Fügen Sie 4 Mikrogramm Plasmid-DNA in die Zellsuspension im Vial hinzu und mischen Sie Zellen und DNA durch vorsichtiges Schwenken. Klopfen Sie das Vial zweimal auf die Oberfläche des Abzugs.

Setzen Sie die Vete in den Kern-Effektorhalter des Kern-Effektorgeräts ein. Wählen Sie Programm B 0 1 6 aus, um die Kern-Effektorzellen zu aktivieren, indem Sie die Taste x drücken. „Okay“ wird angezeigt, wenn der Kern-Affektions-Prozess abgeschlossen ist, was gewöhnlich ein bis fünf Sekunden dauert. Verwenden Sie die im Kern-Affektions-Kit bereitgestellte Plastik-Pasta-Pipette, um die kernaffektionierten Zellen aus der Vete zu entnehmen. Lösen Sie die Zellen durch Resuspendierung in vorgewärmtem CM und Rock-Inhibitor in einem sterilen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen auf und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach 10 Minuten die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze tropfenweise auf die Füttererschichten überführen. Die Zellen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Transfektionseffizienz überwachen.

Abgebildet sind hier Fotomikrografien von EGFP-exprimierenden RIV-ein menschlichen iPSC-Zellen, die mittels Gene Juice auf Gel Rex 12 Stunden nach der Transfektion mit Plasmid-DNA transfiziert wurden. DNA-Transfektion menschlicher iPSCs. Die Verwendung von Gene Juice mit einem starken Promotor führt typischerweise in einem transienten Transfektionsassay zu mehr als 60 % EGFP-Reporter-exprimierender Zellen.

EGFP-exprimierende Zellen können auch durch nukleäre Transfektion erhalten werden, wie in diesen Bildern von RIV-eins menschlichen IPCs gezeigt, die nach nuklearer Transfektion unter Verwendung entweder des B 0 1 6-Programms für nukleare Transfektion oder des A 0 2 3-Programms für nukleare Transfektion auf Fütterungszellen platziert und kultiviert wurden. Die Anwendung des B 0 1 6-Programms führt zu bis zu 80 % EGFP-positiven Zellen, während das A 0 2 3-Programm weniger als 10 % EGFP-positiver Zellen ergab. Darüber hinaus können stabile Klone transgener menschlicher iPSCs, die das Transgen exprimieren, gewonnen werden.

Ein Beispiel stabiler EGFP-exprimierender humaner iPSC-Kolonien mit ubiquitärer EGFP-Expression, die von Gene Juice stammt, wird hier gezeigt. Diese Zellen behalten während der Embryoidkörper-Differenzierung eine konstitutive EGFP-Expression bei. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane iPSCs nukleofizieren und transfizieren kann.

Eine effiziente genetische Manipulation ist ein unverzichtbares Werkzeug, um verschiedene Aspekte der Stammzellbiologie zu untersuchen, und wird die Verwendung menschlicher iPS-Zelllinien in der regenerativen Medizin beschleunigen.