Generierung kortikaler Pyramidenneuronen aus humanen neuralen Stammzellen

In einer Kulturplatte wird ein Deckglas mit Polyornithin, einem positiv geladenen Polymer, bestreicht und inkubiert.

Polyornithin bildet eine netzartige Schicht, die negativ geladenen Zellen hilft, am Deckglas zu haften.

Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Deckgläser mit einer gepufferten Salzlösung, um ungebundenes Polyornithin zu entfernen.

Fügen Sie eine Lösung hinzu, die ein extrazelluläres Matrixprotein namens Laminin enthält, und inkubieren Sie.

Laminin bildet eine Matrix über dem mit Polyornithin beschichteten Deckglas und verbessert so die Zellanhaftung.

Verwerfen Sie die Lösung und entnehmen Sie eine kleine Anzahl neuraler Stammzellen, die in einem wachstumsfaktorfreien Medium suspendiert sind.

Geben Sie diese Kultur mit niedriger Dichte in einer langsamen Drehbewegung über das vorbereitete Deckglas, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Zunächst

fördert der Entzug von Wachstumsfaktoren die Zellteilung.

Im Laufe der Zeit differenzieren sich Stammzellen zu Neuronen mit langen Fortsätzen

Schließlich produzieren Neuronen stachelartige Strukturen über ihren Projektionen, wie die kortikalen Pyramidenneuronen.

Um neuronale Kulturen zuzubereiten, legen Sie gläserne Deckgläser in Sechs-Well-Kulturschalen und fügen Sie Polyornithin hinzu. Über Nacht unter einer Strömungshaube inkubieren. Am nächsten Tag die Deckgläser mit DPBS dreimal waschen und Laminin hinzufügen. Mindestens 10 Stunden unter einer Strömungshaube inkubieren.

Bereiten Sie den Nährboden vor, der die folgenden Komponenten enthält. Verwenden Sie dann das Medium, um neurale Stammzellen oder NSCs mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu plattieren und zu versenden, wobei Sie mit langsamen rotierenden Bewegungen pipettieren, um die Zellclusterbildung zu reduzieren.