In-vitro-Induktion neuromuskulärer Verbindungen aus gentechnisch veränderten humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Beginnen Sie mit gentechnisch veränderten humanen iPSCs, die ein Myoblasten-Differenzierungs- oder MYOD-Protein-kodierendes, Doxycyclin-induzierbares Gen in einem Stammzellmedium enthalten, das Rho-Kinase-Inhibitoren enthält.

Übertragen Sie die Zellen auf EZM-beschichtete Platten und inkubieren Sie, um die Zelladhäsion zu fördern.

In der Zwischenzeit inaktiviert der Inhibitor intrazelluläre Rho-Kinase-Enzyme und verbessert so die Lebensfähigkeit der Zellen.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Stammzellmedium, das Doxycyclin enthält.

Doxycyclin dringt in die Zellen ein und bindet an Aktivatorproteine. Diese Komplexe binden an den Promotor, induzieren die Genexpression in einigen Zellen und produzieren MYOD-Proteine, die die Differenzierung von Stammzellen in Muskelzellen auslösen.

Behandeln Sie die Zellen mit einem myogenen Differenzierungsmedium, das myogene Differenzierungsfaktoren enthält, um die Bildung von Myotuben, einer mehrkernigen Muskelzelle, zu fördern.

Führen Sie später ein neuronales Induktionsmedium mit neuronalen Wachstumsfaktoren ein.

Diese Faktoren differenzieren die verbleibenden iPSCs in Motoneuronen und Schwann-Zellen, die eine Myelinscheide um die Neuronen bilden.