Eine Technik zur Optimierung der zerebralen Organoidkultur unter Verwendung von lateraler Soft-Light-Beleuchtung

Nehmen Sie ein seitliches Soft-Light-Beleuchtungs-Setup, das eine Acrylplatte mit weißen Pads und weißen LED-Leuchten an einer Kante enthält.

Positionieren Sie eine Multi-Well-Platte mit geringer Adhäsion mit dem Medium zur Bildung des Embryoidkörpers davor.

Gib die Embryoidkörper oder EBs auf die Platte.

Das LED-Licht tritt von der Seite der Acrylplatte ein und strahlt parallele Strahlen aus, die die EBs seitlich beleuchten und eine Visualisierung mit bloßem Auge ermöglichen.

Drehen Sie die Platte, um eine Wirbelströmung zu induzieren, bei der die EBs zur Mitte konvergieren.

Ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch frisches EB-Bildungsmedium.

Sammeln Sie die EBs mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang.

Halten Sie die Pipette aufrecht, damit sich die EBs durch die Schwerkraft absetzen können.

Übertragen Sie die EBs auf eine andere Platte mit geringer Adhäsion, die ein neuronales Induktionsmedium enthält.

Berühren Sie mit der Spitze das Medium. Die EBs sinken aufgrund der Oberflächenspannung der Flüssigkeit.

Spezifische Faktoren im Medium initiieren die neuronale Differenzierung in den EBs, wodurch eine neuroepitheliale Schicht gebildet wird.

Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3 bis 0,5 Zentimetern in der Größe von A5-Papier und kleben Sie weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte. Installieren Sie als Nächstes eine Reihe weißer LED-Leuchten am Rand der Platte, so dass die Leuchten von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können.

Bereiten Sie nun eine neue Sechs-Well-Platte mit geringer Adhäsion vor und fügen Sie 2 Milliliter EB-Bildungsmedium zu jeder Vertiefung hinzu. Nachdem Sie die EBs zusammen mit dem Medium entfernt haben, übertragen Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze mit breiter Bohrung etwa 100 EBs pro Vertiefung auf die 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion.

Um das EB-Bildungsmedium jeden Tag durch das gleiche Volumen an frischem Medium zu ersetzen, induzieren Sie eine Wirbelströmung, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung zum Zentrum des Bohrlochs. Aspirieren Sie das alte Medium, indem Sie langsam an den Rand der Vertiefung pipettieren. Saugen Sie nicht zu stark, da sonst die EBs zusammen entfernt werden. Fügen Sie dann neue Medien hinzu, um die EBs erneut zu suspendieren.

Bereiten Sie für die neuronale Induktion eine neue 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion mit 3 Millilitern neuronalem Induktionsmedium pro Well vor. Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein und schalten Sie andere Lichtquellen im Innenbereich aus. Übertragen Sie nun die EBs auf die 6-Well-Platte mit zusätzlichem neuronalem Induktionsmedium, indem Sie mit einer Weithalspipettenspitze sowohl die EBs als auch das Kulturmedium absaugen. Halten Sie dann die Pipette aufrecht. Die EBs sinken allmählich unter der Schwerkraft ab und konvergieren in Richtung der Mündung der Pipettenspitze.

Wenn die Öffnung der Pipettenspitze wieder die Flüssigkeitsoberfläche berührt und aufgrund der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, sinken die EBs schnell in das Medium. Inkubieren Sie die Proben 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.