Eine Technik zur Optimierung der zerebralen Organoidkultur unter Verwendung von lateraler Soft-Light-Beleuchtung
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:43 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie ein seitliches Soft-Light-Beleuchtungs-Setup, das eine Acrylplatte mit weißen Pads und weißen LED-Leuchten an einer Kante enthält.
Positionieren Sie eine Multi-Well-Platte mit geringer Adhäsion mit dem Medium zur Bildung des Embryoidkörpers davor.
Gib die Embryoidkörper oder EBs auf die Platte.
Das LED-Licht tritt von der Seite der Acrylplatte ein und strahlt parallele Strahlen aus, die die EBs seitlich beleuchten und eine Visualisierung mit bloßem Auge ermöglichen.
Drehen Sie die Platte, um eine Wirbelströmung zu induzieren, bei der die EBs zur Mitte konvergieren.
Ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch frisches EB-Bildungsmedium.
Sammeln Sie die EBs mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang.
Halten Sie die Pipette aufrecht, damit sich die EBs durch die Schwerkraft absetzen können.
Übertragen Sie die EBs auf eine andere Platte mit geringer Adhäsion, die ein neuronales Induktionsmedium enthält.
Berühren Sie mit der Spitze das Medium. Die EBs sinken aufgrund der Oberflächenspannung der Flüssigkeit.
Spezifische Faktoren im Medium initiieren die neuronale Differenzierung in den EBs, wodurch eine neuroepitheliale Schicht gebildet wird.
Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3 bis 0,5 Zentimetern in der Größe von A5-Papier und kleben Sie weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte. Installieren Sie als Nächstes eine Reihe weißer LED-Leuchten am Rand der Platte, so dass die Leuchten von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können.
Bereiten Sie nun eine neue Sechs-Well-Platte mit geringer Adhäsion vor und fügen Sie 2 Milliliter EB-Bildungsmedium zu jeder Vertiefung hinzu. Nachdem Sie die EBs zusammen mit dem Medium entfernt haben, übertragen Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze mit breiter Bohrung etwa 100 EBs pro Vertiefung auf die 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion.
Um das EB-Bildungsmedium jeden Tag durch das gleiche Volumen an frischem Medium zu ersetzen, induzieren Sie eine Wirbelströmung, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung zum Zentrum des Bohrlochs. Aspirieren Sie das alte Medium, indem Sie langsam an den Rand der Vertiefung pipettieren. Saugen Sie nicht zu stark, da sonst die EBs zusammen entfernt werden. Fügen Sie dann neue Medien hinzu, um die EBs erneut zu suspendieren.
Bereiten Sie für die neuronale Induktion eine neue 6-Well-Platte mit geringer Adhäsion mit 3 Millilitern neuronalem Induktionsmedium pro Well vor. Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein und schalten Sie andere Lichtquellen im Innenbereich aus. Übertragen Sie nun die EBs auf die 6-Well-Platte mit zusätzlichem neuronalem Induktionsmedium, indem Sie mit einer Weithalspipettenspitze sowohl die EBs als auch das Kulturmedium absaugen. Halten Sie dann die Pipette aufrecht. Die EBs sinken allmählich unter der Schwerkraft ab und konvergieren in Richtung der Mündung der Pipettenspitze.
Wenn die Öffnung der Pipettenspitze wieder die Flüssigkeitsoberfläche berührt und aufgrund der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, sinken die EBs schnell in das Medium. Inkubieren Sie die Proben 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine laterale Technik mit weicher Lichtbeleuchtung vorgestellt, die darauf ausgelegt ist, die Visualisierung und Handhabung von embryonalen Körpern (EBs) während der zerebralen Organoidkultur zu verbessern. Das Protokoll beschreibt detailliert den Aufbau des Beleuchtungssystems, die Verfahren für Mediumswechsel, den Transfer der EBs sowie die Induktion der neuronalen Differenzierung und ermöglicht so eine effiziente Entwicklung zerebraler Organoiden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Neurowissenschaften
- Organoid-Technologie
Hintergrund
- Zerebrale Organoiden sind wertvolle Modelle zur Untersuchung der menschlichen Gehirnentwicklung und von Erkrankungen.
- Die Manipulation und Übertragung von embryonalen Körpern (EBs) kann aufgrund schlechter Sichtbarkeit unter Standard-Kulturbedingungen schwierig sein.
- Verbesserte Visualisierungstechniken können die Effizienz und Reproduzierbarkeit von Organoid-Kulturarbeitsabläufen erhöhen.
- Die seitliche weiche Lichtbeleuchtung bietet eine einfache und kostengünstige Lösung für eine bessere Beobachtung von EBs mit bloßem Auge.
Zweck der Studie
- Einführung und Validierung einer lateralen, weichen Lichtbeleuchtung zur verbesserten Visualisierung von EBs.
- Erleichterung der Manipulation und Übertragung von EBs während der zerebralen Organoidkultur.
- Vorlage eines Schritt-für-Schritt-Protokolls für Mediumswechsel und neurale Induktion unter Verwendung dieser Beleuchtungsmethode.
Verwendete Methoden
- Konstruktion einer Acrylplatte mit weißen Auflagen und seitlich angebrachten weißen LED-Leuchten für die laterale Beleuchtung.
- Kultivierung von EBs in Mehrmuldenplatten mit geringer Adhäsivität mit EB-Bildungsmedium.
- Täglicher Mediumwechsel unter Verwendung eines Wirbelstroms zur Zentrierung der EBs und vorsichtigen Pipettieren, um Verluste zu vermeiden.
- Übertragung der EBs in neuronales Induktionsmedium mithilfe von Pipettenspitzen mit großem Durchmesser, unterstützt durch die Beleuchtungseinrichtung.
- Bebrütung der EBs zur neuronalen Differenzierung bei 37 °C und 5 % CO2.
Hauptergebnisse
- Die seitliche, weiche Lichtbeleuchtung verbessert die Sichtbarkeit von EBs in Kulturplatten für das bloße Auge erheblich.
- Die Technik ermöglicht eine präzisere und effizientere Handhabung und Übertragung der EBs.
- Durch Wirbelströmung und sorgfältiges Pipettieren lassen sich effektive Mediumwechsel ohne Verlust von EBs durchführen.
- Die neuronale Induktion der EBs verläuft erfolgreich und führt zur Bildung einer neuroepithelialen Schicht.
Schlussfolgerungen
- Die laterale weiche Lichtbeleuchtung ist eine praktische und effektive Methode zur Unterstützung der Kultur zerebraler Organoiden.
- Der Ansatz verbessert die Visualisierung, Manipulation und Übertragung von embryonalen Körperchen (EBs) und erhöht so die Effizienz des Arbeitsablaufs.
- Diese Technik kann problemlos in Laboren übernommen werden, die mit Organoid-Systemen arbeiten.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Visualisierung von Embryoidkörpern (EBs) während der frühen Differenzierung stellt weiterhin eine Engstelle in der auf Stammzellen basierenden Arzneimittelforschung und Zielstrukturenvalidierung dar. Seitliche, weiche Lichtbeleuchtung ermöglicht die Beobachtung der EB-Aggregation und -Handhabung mit bloßem Auge und verbessert so die Reproduzierbarkeit in Workflows zur neuralen Induktion. Dies unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem eine einfache und skalierbare Methode bereitgestellt wird, um frühe neurodevelopmentale Phänotypen in vitro zu bewerten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung der Embryoidkörperbildung und -aggregation und unterstützt dadurch die Hypothesenprüfung bei der Differenzierung pluripotenter Stammzellen.
- Operativer Wert: Verringert die Abhängigkeit von komplexen Abbildungssystemen für die routinemäßige Überwachung von Embryoidkörpern während der Kulturpflege.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die frühzeitige Erkennung der Differenzierungskompetenz und unterstützt so die Zielvalidierung für neurodevelopmentelle Signalwege.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Standardisiert das Handling und den Transfer von EBs und verbessert so die Konsistenz bei der Einrichtung von Wirkstoff-Screenings mit Modellen basierend auf Embryoidkörpern.
- Quantifizierbare Ausgabe: Ermöglicht die reproduzierbare Sammlung und Aufzucht von EBs und unterstützt damit standardisierte Dosierung und Auswertung im phänotypischen Screening.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Mehrfach-Well-Plattenformaten, wodurch die parallele Verarbeitung von EB-Populationen für die Optimierung von Assays ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Unterstützt die Generierung neuroepithelialer Schichten aus embryonalen Körpern und bietet ein krankheitsrelevantes System für frühe präklinische Modellierung.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Ermöglicht die visuelle Bestätigung des Fortschritts der neuralen Induktion und verringert damit die Uneindeutigkeit hinsichtlich der Differenzierungseffizienz vor nachgeschalteten Anwendungen.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die zeitnahe Probennahme differenzierter embryonaler Körper zur Analyse von Biomarkern in Studien zur Modulation neurodevelopmentaler Signalwege.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Technik integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Stammzellkultur bis hin zur frühen neuronalen Differenzierung und unterstützt so die Identifizierung von Leitverbindungen sowie die präklinische Validierung.
- Entdeckungsbiochemie Verbessert die Hypothesenprüfung, indem die Echtzeit-Visualisierung des Verhaltens von EBs während Mediumwechseln und Transfers ermöglicht wird.
- Screening: Verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays durch Standardisierung der EB-Konzentration und -Übertragung mittels Wirbelströmung und gravitationsbasiertem Pipettieren.
- Analytik: Stellt konsistente EB-Populationen für die nachgeschaltete Analyse bereit und verbessert so die Vergleichbarkeit der Daten über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg.
- Translationale Forschung Unterstützt die Bildung neuroepithelialer Schichten und verbindet die in-vitro-Differenzierung mit präklinischen Modellen der neurodevelopmentalen Forschung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine kostengünstige, wiederverwendbare Plattform für die routinemäßige Kultur von Embryoiden über mehrere Stammzelllinien und Differenzierungsprotokolle hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in Differenzierungsergebnisse, indem die visuelle Verfolgung der Embryoid-Morphologie und -Aggregation ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Vereinfacht den Arbeitsablauf mit minimalem Equipment – Acrylplatte, LED-Leuchten und niedrig haftenden Platten – und verringert so die technische Variabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortsetzung oder Abbruch in der frühen Differenzierung, indem beobachtbare Kriterien für den Erfolg der neuralen Induktion bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Stammzelllinien basierend auf der sichtbaren Kompetenz der Embryoiden und ihrer Differenzierungsbereitschaft.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Erfahrung in der Stammzellkultur und Vertrautheit mit niedrig-adhäsiven Oberflächen, um die Anheftung von Embryoiden Körpern (EBs) zu verhindern.
- Hängt von der Verfügbarkeit weißer LED-Leuchten und transparenter Acrylplatten für die seitliche Beleuchtung ab.
- Setzt eine standardisierte Wirbelströmungstechnik voraus, um den Verlust von EBs während Mediumwechseln zu vermeiden.
- Muss bei der Anpassung an verschiedene EB-Größen und Kulturvolumina an unterschiedliche Wells-Formate angepasst werden.
- Auf durchscheinende Proben beschränkt; die Wirksamkeit kann bei dichten oder pigmentierten Organoidkulturen abnehmen.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026