Differenzierung embryonaler Stammzellen der Maus zu einer vernetzten Neuronenpopulation

Embryonale Stammzellen von Mäusen in einer Schale mit geringer Bindung säen, die Differenzierungsmedien enthält.

Inkubieren Sie unter Rotation, um die zelluläre Aggregation und Differenzierung zu einer neuronalen Linie zu erleichtern.

Übertragen Sie die Zuschlagstoffe in ein Rohr und lassen Sie sie durch die Schwerkraft absetzen. Entsorgen Sie die Medien.

Resuspendieren Sie die Aggregate und überführen Sie sie in die ursprüngliche Schale, die Differenzierungsmedien enthält, die mit Retinsäure ergänzt sind.

Retinsäure induziert die neuronale Genexpression und löst die Differenzierung in neurale Vorläuferzellen aus.

Übertragen Sie die Aggregate in ein Rohr. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie Trypsin hinzu, um die Aggregate zu dissoziieren.

Fügen Sie einen Inhibitor hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.

Wiederholtes Pipettieren zur Gewinnung einer homogenen Zellsuspension. Filtern Sie die Suspension, um Zuschlagstoffe zu entfernen.

Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in Medien.

Säen Sie die Zellen auf einer polymerbeschichteten Schale, um die Zelladhäsion zu erleichtern.

Entfernen Sie das Medium. Fügen Sie frische Medien hinzu, die Wachstumsfaktoren enthalten, um die neuronale Reifung zu fördern und eine vernetzte Neuronenpopulation zu bilden.

Die Differenzierung von ESCs in Neuronen beginnt während einer routinemäßigen Zellpassage. Dissoziieren Sie die ESCs wie bisher, fügen Sie jedoch eine zusätzliche Platte für die neuronale Differenzierung hinzu. Übertragen Sie 350 Mikroliter der Zellsuspension in eine 10 Zentimeter große, niedrig haftende Schale, die 25 Milliliter Differenzierungsmedium enthält.

Stellen Sie die Schale auf einen auf 30 bis 45 U/min eingestellten Orbitalschüttler in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang. Nach 48 Stunden wird eine 25-Milliliter-Pipette verwendet, um die differenzierenden Zellaggregate in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Sie unmittelbar danach 25 Milliliter frisches Differenzierungsmedium in die Petrischale. Lassen Sie die Zuschlagstoffe zwei bis fünf Minuten lang absetzen, so dass ein sichtbares Pellet entsteht, das ein bis zwei Millimeter tief ist. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab, ignorieren Sie einzelne Zellen oder kleine Aggregate, die sich noch in Suspension befinden, und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Zellpellet zurück in die Petrischale zu übertragen. Stellen Sie die Schale wieder in den Drehschüttler im Inkubator. Wiederholen Sie nach weiteren 48 Stunden den Medienwechsel. Diesmal fügen Sie 30 Milliliter Differenzierungsmedium hinzu, das mit sechs mikromolaren all-trans-Retinsäure ergänzt wird.

Das gebildete Pellet ist nun zwei bis vier Millimeter tief. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor inkubiert haben, wiederholen Sie den Medienwechselvorgang mit einer Retinsäure-Supplementierung zum letzten Mal. Das Pellet wird zu diesem Zeitpunkt vier bis acht Millimeter tief sein.

Bereiten Sie am nächsten Tag die Beschichtungsoberflächen vor, wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Tauen Sie am Nachmittag des Tages der Plattierung jeweils 5 Milliliter präaliquotiertes NPC-Trypsinisierungsmedium und 0,1 % Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor bei 37 Grad Celsius auf. Verwenden Sie dann eine 25-Milliliter-Pipette, um differenzierende Aggregate von der Kulturplatte in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen.

Lassen Sie die Zuschlagstoffe drei bis fünf Minuten einwirken und saugen Sie dann das Medium vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie anschließend das Pellet mit 5 bis 10 Millilitern PBS, und nachdem sich die Zuschlagstoffe abgesetzt haben, saugen Sie das PBS an und wiederholen Sie den Waschvorgang. Nach der zweiten PBS-Wäsche fügen Sie dem Pellet 5 Milliliter NPC-Trypsinisierungsmedium hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, wobei Sie das Röhrchen während der Inkubation zwei- bis dreimal vorsichtig schnippen.

Geben Sie als nächstes 5 Milliliter 0,1% Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in die Zellen und mischen Sie schnell durch Invertieren. Anschließend zerreiben Sie die Zellen vorsichtig 10 bis 15 Mal mit einer 10-Milliliter-Pipette, bis eine relativ homogene Zellsuspension entsteht. Filtrieren Sie die Zellsuspension langsam durch ein 40- oder 70-Mikron-Zellsieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.

Sobald die gesamte Suspension filtriert wurde, fügen Sie dem Filter 1 Milliliter N2-Medium hinzu, um die verbleibenden Zellen durch das Sieb zu waschen. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und sechs Minuten lang bei 200 g zentrifugiert.

Nach dem Aspirieren des Mediums, ohne das Pellet zu stören, in 2 Millilitern N2-Medium zerreiben und dann N2-Medium zu einem Gesamtvolumen von 10 Millilitern hinzufügen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 mal g. Aspirieren Sie das Medium und wiederholen Sie den Waschvorgang des Granulats, wobei Sie das Pellet erneut in 10 Millilitern N2-Medium resuspendieren.

Entnehmen Sie ein Aliquot der Zellen, zählen Sie mit einem Hämozytometer und wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen in N2-Medium auf eine Endkonzentration von 1x mal 10⁷ Zellen pro Milliliter und legen Sie sie mit einer Dichte von 150.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter in Schalen, die bei DIV minus 1 zubereitet werden, und stellen Sie sie in den Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Pflegen Sie ESNs gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll.