JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:59 Min. • July 8th, 2025
Nehmen Sie gentechnisch veränderte Bakterien auf einem Nematoden-Wachstumsmedium.
Die Bakterien tragen ein Plasmid mit einem Nematoden-Chromatin-regulierenden Faktor-Gen.
Das Medium enthält einen Induktor, der die Expression einer transgenen RNA-Polymerase aus dem bakteriellen Genom auslöst, die das Chromatin-regulierende Faktor-Gen in eine dsRNA transkribiert.
Füge transgene Nematodenlarven hinzu, die ein Neuronenschicksals-induzierendes Transkriptionsfaktor-Gen unter einem Hitzeschock-Promotor tragen.
Beim Verzehr durch Bakterien erzeugt die aufgenommene dsRNA siRNA, die die Expression des Chromatin-regulierenden Faktors herunterreguliert und so die Reprogrammierung des Zellschicksals erleichtert.
Über die Keimzellen der Eltern wird die siRNA an die Nachkommen weitergegeben.
Die Herunterregulierung der Expression des Chromatin-regulierenden Faktors in den Keimzellen der Nachkommen, die durch einen hervorstehenden Vulva-Phänotyp angezeigt wird, ermöglicht deren Reprogrammierung.
Wenden Sie einen Hitzeschock auf die Nachkommen an, aktivieren Sie den Hitzeschock-Promotor und exprimieren Sie den Transkriptionsfaktor für das Schicksal der Neuronen, der die neuronale Differenzierung auslöst und Keimzellen in Neuronen verwandelt.
Die Neuronen exprimieren ein transgenes fluoreszierendes Reporterprotein, das die mikroskopische Visualisierung erleichtert.
Übertragen Sie manuell 50 L4-Würmer pro Replikat auf eine NGM-RNAi-Platte. Verwende einen Platindraht. L4-Würmer sind an einem weißen Fleck etwa auf halber Höhe ihrer Bauchseiten zu erkennen. Inkubieren Sie die Würmer nun bei 15 Grad Celsius im Dunkeln für etwa sieben Tage. Das IPTG ist lichtempfindlich.
Wenn die F1-Nachkommen die Stadien L3 und L4 erreichen, trennen Sie sie von den größeren, dickeren Elterntieren. Zu diesem Zeitpunkt wird das F1 auf den hervorstehenden Vulva-Phänotyp untersucht, was darauf hindeutet, dass die RNAi gegen lin-53 erfolgreich war. Die RNAi-Aktivität kann auch zur Letalität führen, die auf über 15 Grad Celsius ansteigt. Um G1 zu aktivieren und die Umwandlung von Keimzellen in Neuronen bei den F1-Nachkommen zu induzieren, schocken Sie die Würmer 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Verwenden Sie einen belüfteten Inkubator, da er einen effizienteren Hitzeschock ermöglicht.
Nach dem Hitzeschock die Platten über Nacht bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Es ist wichtig, eine Überexpression von Q1 durch Hitzeschock zu vermeiden, bevor die Tiere das mittlere L3-Stadium erreichen. Dies kann zur Expression des Q1-Proteins in nicht zielgerichteten Geweben führen. Am nächsten Tag stellten Sie eine Fluoreszenzlichtquelle und einen GFP-Filter auf, um die Tiere auf transgene Fluoreszenz im Mittelkörperbereich zu untersuchen.