Etablierung einer Müller-Gliazellkultur aus der Netzhaut von Mäusen

Nehmen wir die Netzhaut von Mäusen, die Müller-Glia- oder MG-Zellen und Neuronen enthalten.

Legen Sie sie in eine Dissoziationslösung mit Verdauungsenzymen und inkubieren Sie sie unter leichtem Schaukeln, um eine gleichmäßige Enzymverteilung zu gewährleisten.

Diese Enzyme brechen die extrazelluläre Matrix auf und lösen einzelne Zellen ab.

Pipettieren Sie die Netzhaut mehrmals auf und ab, um die Zellen freizusetzen.

Fügen Sie einen Inhibitor hinzu, um die Enzymaktivität zu stoppen, und zentrifugieren Sie dann.

Entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie die Zellen in Medien, die einen für MG-Zellen spezifischen Wachstumsfaktor enthalten.

Übertragen Sie die Zellen in eine Vertiefung und inkubieren Sie.

Im Laufe der Zeit erleichtert der Wachstumsfaktor in den Medien das Wachstum und die Vermehrung von MG-Zellen, während die sich nicht teilenden neuronalen Zellen zugrunde gehen.

Entfernen Sie das Medium. Mit einem Salzpuffer waschen.

Inkubieren Sie mit einem Verdauungsenzym, um die Zellen aus der Vertiefung zu lösen.

Sammeln Sie die Zellen in einem Röhrchen und zentrifugieren Sie sie.

Entsorgen Sie den Überstand mit den abgestorbenen neuronalen Zellen.

Resuspendieren Sie die MG-Zellen zur weiteren Analyse in Medien.

Bereiten Sie die Dissoziationsmischung Papain DNase I vor, wie im Manuskript beschrieben. Nehmen Sie nun mit einer vergrößerten Transferpipette die Netzhaut auf. Warten Sie, bis sich die Netzhäute am unteren Ende der Spitze abgesetzt haben, und geben Sie die Netzhaut ohne übermäßiges HBSS in das Röhrchen mit der Papain-DNase I-Mischung ab.

Legen Sie anschließend das Röhrchen auf einen Nährstoffator im Inkubator und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie mit einer 1-Milliliter-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren. Nachdem die Zellen dissoziiert wurden, fügen Sie 275 Mikroliter Ovomucoid-Proteasehemmer aus dem Papain-Dissoziationskit hinzu, um das Papain zu neutralisieren, und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.

Legen Sie die Röhrchen in eine Zentrifuge und drehen Sie sie 8 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei einer relativen Zentrifugalkraft von 300. Fügen Sie dem berechneten Volumen des auf 37 Grad Celsius vorgewärmten Wachstumsmediums den epidermalen Wachstumsfaktor hinzu. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig, ohne das Pellet am Boden des Rohrs zu berühren. Resuspendieren Sie nun das Zellpellet mit 500 Mikrolitern epidermalem Wachstumsfaktor-supplementiertem Wachstumsmedium. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in eine Vertiefung der markierten 12-Well-Platte. Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern des mit dem epidermalen Wachstumsfaktor ergänzten Wachstumsmediums und geben Sie es in die Vertiefung.

Schütteln Sie die Well-Platte vorsichtig. Legen Sie dann die Platte bei 37 Grad Celsius mit Kohlendioxid in den Inkubator. Beginnen Sie mit der Überprüfung der Zellkonfluenz von 90 % bis 100 %. Entfernen Sie dann das Medium und fügen Sie 1 Milliliter kaltes HBSS hinzu, um die Mulde zu waschen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und entfernen Sie HBSS, ohne Spuren zu hinterlassen.

Später fügen Sie 500 Mikroliter einer vorgewärmten trypsinhaltigen Lösung hinzu, um die Zellen aus der Vertiefung zu lösen. Sanft schaukeln und 2 Minuten im 37 Grad Celsius heißen Inkubator inkubieren. Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank gebracht haben, aspirieren Sie die trypsinhaltige Lösung unter Kippen. Verteilen Sie es vorsichtig und langsam mehrmals über die Vertiefung, bis sich die Zellen vollständig lösen.

Übertragen Sie dann diese Zellsuspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie die Röhrchen in die Zentrifuge ein. Bei 300 mal g für 8 Minuten bei 4 Grad Celsius schleudern und die Röhrchen zurück in die Biosicherheitswerkbank bringen. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu berühren. Resuspendieren Sie nun das Zellpellet vorsichtig, indem Sie 600 Mikroliter vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzufügen und etwa 30 bis 40 Mal auf und ab pipettieren.